כתב יד זה מתאר שיטת הקפאה נטולת קרח עבור כמויות גדולות של החולדות החצציטים לפיה התאים הראשוניים הם טרום מודבטים עם סוכנים הקפאה בריכוז נמוך והוא מוקשה בטיפות גדולות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בצובר Droplet ויטריפיקציה עבור שימור ההירופציט הראשי
במאמר זה
סיכום
תקציר
ויטריפיקציה היא חלופה מבטיחה ללא קרח להקפאה קלאסית (בקירוב 1 ° c/דקות) הקפאה של דגימות ביולוגיות. ויטריפיקציה דורש שיעורי צינון מהיר במיוחד כדי להשיג מעבר של מים לשלב הזכוכית תוך הימנעות היווצרות קרח מזיק. למרות שטרום הדגירה עם סוכנים ביולוגיים (CPA) יכול להפחית את שיעור הצינון הקריטי של דגימות ביולוגיות, ריכוזים גבוהים בדרך כלל נדרשים כדי לאפשר הקפאת קרח חינם על ידי ויטריפיקציה. כתוצאה מכך, ויטריפיקציה מושפע מרעילות CPA ומוגבלת לדגימות קטנות שניתן לקרר במהירות. לאחרונה הפגינו כי אלה מגבלות הטבועה ניתן להתגבר על ידי droplet ויטריפיקציה בצובר. באמצעות שיטה זו הרומן, התאים הם הראשונים לקדם מחדש עם ריכוז הרואה חשבון נמוך תאיים. מינוף התייבשות אוסמוטי מהירה, ה-CPA תאיים מרוכז ישירות לקראת ויטריפיקציה, ללא צורך באופן מלא ריכוזי רואי חשבון רעילים. התייבשות הסלולר מבוצעת במכשיר פלואידיג ומשולב עם הדור תפוקה גבוהה רציפה של טיפות בגודל גדול כי הם התמסדים בחנקן נוזלי. שיטת הקפאת הקרח ללא הקפאה עם רעילות CPA מינימלית מתאימה לכמויות התאים הגדולות והתוצאות בכדאיות המוגברת של המעי האטי ובתפקוד המטבולית לעומת הקריוגנית איטית ומקפיאה. כתב יד זה מתאר את השיטות עבור droplet בצובר מוצלחת ויטריפיקציה בפירוט.
מבוא
הפסד של הכדאיות התאית ותפקוד מטבולית לאחר קריוגנית של hepatocytes עדיין בעיה מרכזית המגבילה יישומים קליניים1,2,3. שיטת בחינת הסדר של ההיפציט הקריוגנית היא איטית-הקפאה, אשר מבוצעת על ידי הפרה מראש של hepatocyte עם CPA (diמתיל סולפוקסיד [dmso], גלוקוז, ו-אלבומין, הקפאת קצב מבוקרת (בקירוב 1 ° c/min) כדי ל טמפרטורות קריוגניים4,5. למרות מיטובי הדיווחים רבים, הרעלת רואי חשבון ביחד עם חוסר איזון אוסמוטי מזיק במהלך הקפאת הלחץ מכני של היווצרות קרח להישאר החסרונות הבסיסיים של קיפאון איטי6,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
החרופציט העיקרי עבור פרוטוקול זה בוצעו על-ידי ליבת משאבי התא (CRC) בבית החולים הכללי של מסצ, בוסטון, מסצ, ארה ב. פרוטוקול החיות (#2011N000111) אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של בית החולים הכללי של מסצ.
1. droplet גורפת ויטריפיקציה
- הכינו את הפתרונות הויטריפיקציה.
- הוסף 40 מ"ג של סרום של שור (BSA) כדי 17.0 mL של הפתרון של אוניברסיטת ויסקונסין (UW) כדי להפוך פתרון ויטריפיקציה 1 (V1). המסנן הסטרילי מסנן את הפתרון V1 באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר ואחסן ב-4 ° c.
הערה: UW הוא פתרון נפוץ לשימור איברים. הוא מכיל 50 g/L הידרוקסיל עמילן, 35.83 g/L חומצה lactoביונית, 3.4 g/L אשלגן פוספט monobasic....
- הוסף 40 מ"ג של סרום של שור (BSA) כדי 17.0 mL של הפתרון של אוניברסיטת ויסקונסין (UW) כדי להפוך פתרון ויטריפיקציה 1 (V1). המסנן הסטרילי מסנן את הפתרון V1 באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר ואחסן ב-4 ° c.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בידוד הראשי הראשוני מבודדים מחמישה כבדי חולדה שונים שימשו להשוואת השוואה ישירה של droplet בצובר ויטריפיקציה כדי הקפאה קלאסית באמצעות פרוטוקולי ההקפאה הראשונה שדווחו בספרות4, 5. בקיצור, hepatocytes הושעו ב UW שיושלם עם BSA (2.2 mg/mL), גלוקוז (333 mM), ו DMSO (10% v/v) קפוא באמצעות מקפיא קצב מבוקר. לאחר האחסון ב-196 ° c, הופלו הדגימות באמבט מים חמים. לאחר כל הקרח נמס, DMSO היה מדולל ישירות בעוד ריכוז הגלוקוז הופחת בהדרגה במהלך שלבים מרובים כדי להפחית את הפציעה או.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הקפאת ההזמנה של hepatocytes על ידי הקפאה איטית תוצאות הכדאיות מופחתת פונקציה מטבולית. ויטריפיקציה מציעה חלופה מבטיחה לקריוגנית קלאסית, כאשר הפציעה הקפואה נמנעת לחלוטין9. עם זאת, טרום דגירה עם CPAs נדרש כדי להקטין את קצב הקירור הקריטי8. כתוצאה מכך, הויטריפיקציה מהרעילות של רואי החשבון17 ומוגבלת לנפחים קטנים של מדגם. במאמצים להתגבר על מגבלות אלה ויטריפיקציה בצובר השיטה droplet שהוצגו בכתב יד זה פותחה כדי לאפשר ויטריפיקציה של כמויות גדולות של תאים תוך ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים. ד ר דה פריז, וואנג, טונר, Tessier, ו Ugun יש בקשות פטנט הזמניים הרלוונטיים למחקר זה. לד ר אויגאן יש אינטרס פיננסי בפתרונות איברים, חברה המתמקדת בפיתוח טכנולוגיית שימור איברים. כל האינטרסים של החוקרים מנוהלים על ידי הבריאות של MGH ושותפים בהתאם לסכסוך המדיניות שלהם.
תודות
מימון ממוסדות הבריאות הלאומיים של ארה ב (R01DK096075, R01DK107875, R01DK114506) ומשרד ההגנה של ארה ב (משרד הבטחון RTRP W81XWH-17-1-0680) מודה מאוד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרקים חד פעמיים BD 3 מ"ל עם טיפים Luer-Lok | פישר סיינטיפיק | 14-823-435 | |
| סיגמא-אולדריץ' | CLS1000-250 | ||
| Belzer UW פתרון אחסון קר | גשר לחיים | BUW-001 | |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא-אולדריץ' | A7906 | |
| Cole-Parmer נקבה לואר ל-1/16 אינץ' דוקרני צינורות קשיחים למחצה בפרופיל נמוך, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| מיכל סטראג' קריוגנטי / תרשים קריוטנק | תעשיות | MVE 800 | |
| דימתיל סולפוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | D8418 | |
| DMEM, אבקה, גלוקוז גבוה, פירובט | Life Technologies | 12800-082 | |
| אתילן גליקול | סיגמא-אולדריץ' | 107-21-1 | |
| מלקחיים | ארוכים במיוחדפישר סיינטיפיק | 10-316C | |
| פישרברנד צינורות צנטריפוגה מפלסטיק במהירות גבוהה יותר - סגירת מעגל עליונה שטוחה | פישר סיינטיפיק | 06-443-18 | |
| חוט דיג | Stren | SOFS4-15 | |
| חנקן נוזלי | איירגז | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S צינורות סיליקון מרפא פלטינה, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| טיפים לערבב, לשימוש עם 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene פוליפרופילן משפך אבקת | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| מחט 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M - סרט גמיש | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| סכין גילוח | Fisher Scientific | 12-640 | |
| מרית | קול-פארמר | EW-06369-18 | מסנן סטרילי |
| Steriflip | פישר סיינטיפיק | SE1M179M6 | |
| סוכרוז (גבישי/מוסמך ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| משאבת מזרק | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| מיכל חנקן נוזלי ספסל תרמו-בקבוק | ThermoFisher | 2122 |
מקורות
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
