活细胞成像评估有丝分裂纺锤体扰动后中期持续时间动态变化及细胞命运

摘要

本文介绍了一种评估纺锤体形成和有丝分裂进程动态变化的实验方案。通过应用延时成像技术，使用者能够识别处于有丝分裂不同阶段的细胞，追踪并鉴定有丝分裂缺陷，并分析在抗有丝分裂药物处理下纺锤体的动态行为及有丝分裂细胞的命运。

摘要

活细胞延时成像技术是细胞生物学中的重要工具，能够揭示那些通过固定细胞分析可能被忽略、误解或误读的细胞过程。尽管固定细胞成像与分析方法稳健且足以观察细胞的稳态，但在定义细胞事件的时间顺序方面存在局限性，难以评估包括有丝分裂进程在内的动态过程的瞬时特性。相比之下，活细胞成像是一种有效的工具，可用于在单细胞水平上随时间观察细胞过程，并能够捕捉到在固定细胞成像中难以充分呈现的动态行为。本文介绍了一种构建携带染色质和微管荧光标记物的细胞的方法，并阐述了如何利用这些细胞进行活细胞成像，以监测中期染色体排列和有丝分裂退出过程。我们描述了基于成像的技术，用于评估纺锤体形成和有丝分裂进程的动态变化，包括识别处于有丝分裂不同阶段的细胞、识别 并追踪有丝分裂缺陷、以及在使用有丝分裂抑制剂处理后对纺锤体动态和有丝分裂细胞命运的分析。

引言

基于图像的固定细胞分析常用于评估细胞群体在各种扰动下的变化。当结合细胞同步化，并随后收集和成像一系列时间点时，此类方法可用于推断细胞事件的发生顺序。然而，固定细胞成像的局限性在于，其时间关系是基于细胞群体推断得出的，而非在单个细胞水平上直接证实。因此，尽管固定细胞成像与分析足以观察显著的表型变化和稳态改变，但在检测随时间发生的瞬时变化以及仅影响部分细胞亚群的变化方面仍存在不足。相比之下，活细胞成像是一种有力的技术，可用于在时间序列上观察单个细胞或细胞群体内的细胞及亚细胞过程，且无需依赖可能本身影响细胞行为的同步化手段^1,2,3,4,5,6。

双极有丝分裂纺锤体的形成对于细胞分裂过程中染色体的正确分离至关重要，从而产生两个遗传上完全相同的子细胞。有丝分裂纺锤体结构的缺陷会破坏有丝分裂进程，降低染色体分离的保真度，可能导致灾难性的细胞分裂并降低细胞存活率。因此，能够改变纺锤体形成的有丝分裂抑制剂在抑制癌细胞快速增殖方面具有良好的治疗前景⁷

方案

1. 生成稳定表达RFP-Histone 2B（RFP-H2B）和α-tubulin-EGFP（tub-EGFP）的hTERT-RPE-1细胞

注意：所有步骤均需遵循无菌操作技术，并在生物安全二级增强型（BSL2+）安全柜中进行。

1. 根据脂质体转染递送系统的说明书，通过将相应的慢病毒质粒转染293T细胞，生成携带目的基因（α-微管蛋白-EGFP和RFP-H2B）的逆转录病毒。
   1. 第1天：使用一次性玻璃巴斯德吸管吸取亚融合状态293T细胞培养板中的培养基，并加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤残留培养基。轻轻摇晃使PBS均匀覆盖培养板底部，然后用无菌一次性玻璃巴斯德吸管吸除PBS。
   2. 加入2 mL预热至37 °C的0.05%胰蛋白酶，将培养板放回37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育2至5分钟，使贴壁细胞从培养皿表面脱落。
   3. 向含有胰蛋白酶的培养板中加入8 mL补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的新鲜DMEM培养基。
   4. 轻轻吹打使细胞重悬，将细胞悬液转移至无菌15 mL锥形离心管中。将离心管放入平衡好的离心机，于室温下以161 x g离心5分钟，轻柔地沉淀细胞。
   5. 吸除上清液（含胰蛋白酶溶液），将细胞重悬于10 mL补充有10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中。使用血细胞计数板对....

结果

在纺锤体受到扰动的情况下评估有丝分裂进程
纺锤体极聚焦的调控是正确形成双极纺锤体的关键步骤。通过蛋白耗竭、药物抑制或中心体数量改变而破坏该过程，会导致纺锤体结构异常，并延迟或阻滞有丝分裂进程^10,11,12,13。然而，某些扰动仅会暂时性延迟纺锤体形成，细胞最终仍能进入有丝分裂并完成后期染色体分离¹⁴。在不使用可能间接影响有丝分裂过程的细胞同步化方法的情况下^1,2，细胞以异步方式通过有丝分裂阶段（图2C）。利用RFP-H2.......

讨论

延时成像提供的时间分辨率使得能够可视化并评估单个细胞内连续发生的细胞事件。传统方法通常依赖于细胞同步化，随后在不同时间点收集并固定细胞，但这种方法存在局限性，因为最终的比较实际上是在细胞群体之间进行的。在细胞对扰动的响应不均一，或所观察过程具有动态特性的条件下，活细胞延时成像更适用于追踪和分析单个细胞的动态行为以及细胞群体内部的异质性。因此，延时成像在监测细胞经历有丝分裂各个动态阶段的过程，以及评估对这一进程的干扰如何最终影响有丝分裂的保真度和后续细胞命运方面尤为有用。

尽管活细胞成像具有诸多优势，但在实际操作中仍存在一些重大挑战，必须予以充分考虑并尽可能加以克服。其中一个挑战是维持适当的环境条件，以确保成像过程中细胞的存活与增殖。为此，成像系统必须配备能够调控温度和CO₂浓度的环境培养箱。或者，若在密闭培养腔内进行短期成像，也可仅控制温度。在这两种情况下，均应使用防震台和/或基于硬件的轴向聚焦稳定技术（例如尼康的Perfect Focus系统），以在整个实验过程中维持培养板的聚焦稳定。活细胞成像的另一个重要问题是光损伤和荧光淬灭（photobleaching.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶	Gibo-Life Sciences	25-510	一种用于从培养皿中解离贴壁细胞的丝氨酸蛋白酶
15 ml 离心管	奥林巴斯塑料公司	28-101
20x CFI Plan Fluor 物镜	尼康		用于活细胞成像，以同时观察明场和荧光图像
293T细胞	ATCC	CRL-3216	用于逆转录病毒转染；在步骤 1.1 中使用
α-tubulin-EGFP	Addgene	不同的数量	表达载体，用于编码与绿色荧光蛋白标签融合的α-微管蛋白；适用于活细胞成像中微管蛋白的可视化：可通过Addgene及其他供应商商业获取
Alisertib	Selleckchem	S1133	有丝分裂激酶Aurora A的小分子抑制剂。DMSO中储存浓度为10 mM，使用时终浓度为100 nM。
Blasticidin	Invitrogen	A11139-03	抗生素筛选剂；用于筛选表达 a-tub-EGFP 的细胞
C02	Airgas		用于细胞培养和活细胞成像
Chroma ET-DS 红色（TRITC/Cy3）	色度	49005	单波段滤光片组；激发波长545 nm，带宽25 nm，发射波长605 nm，带宽70 nm；用于H2B-RFP的可视化
Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)	色度	49002	单波段滤光片组；激发波长470 nm，带宽40 nm，发射波长525 nm，带宽50 nm；用于GFP-微管蛋白的观察
一次性玻璃巴斯德吸管，已灭菌	Fisher Scientific	13-678-6A	用于吸取细胞
杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）	Gibo-Life sciences	11965-084	RPE-1 和 293T 细胞生长用细胞培养基
胎牛血清（FBS）	Gibo-Life sciences	10438-026	细胞培养基添加剂
Lipofectamine 3000 和 p3000	Invitrogen	L3000-015	基于脂质的转染试剂，用于质粒转染；在1.1.4中使用
多孔组织培养皿	康宁	各种	用于细胞培养、转染/感染及活细胞成像
尼康 Ti-E 显微镜	尼康		用于活细胞成像的倒置落射荧光显微镜
NIS 元素 HC	尼康	版本 4.51	图像采集与分析软件；用于第3节 &和 4
OPTI-MEM	Gibo-Life sciences	31985-070	用于细胞转染的低血清培养基；在步骤 1.1.3 中使用
青霉素/链霉素	Gibo-Life sciences	15140-122	细胞培养基中使用的抗生素
磷酸盐缓冲液（PBS）	Caisson 实验室	PBP06-10X1LT	用于细胞培养的无菌生理盐水溶液
pMD2.G	Addgene	12259	慢病毒VSV-G包膜表达载体；用于步骤1.1.4
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268	用于增强病毒感染效率的阳离子聚合物；在步骤 1.1.10 中使用
psPAX	Addgene	12260	第二代慢病毒包装质粒；用于步骤 1.1.4
嘌呤霉素	Invitrogen	ant-pr-1	抗生素筛选剂；用于筛选表达 RFP-H2B 的细胞
RFP-组蛋白2B（H2B）	Addgene	不同的数量	用于活细胞成像中染色质可视化研究的红色荧光蛋白标记组蛋白2B表达载体：可通过Addgene及其他供应商商业获取
RNAi Max	Invitrogen	13778-150	基于脂质的siRNA转染试剂
RPE-1 细胞	ATCC	CRL-4000	人视网膜色素上皮细胞系
组织培养皿 100×20 mm	康宁	353003	用于培养贴壁细胞
Zyla sCMOS 相机	尼康		连接至显微镜的相机，用于捕获细胞图像