Presentert her er en protokoll for berikende pachytene spermatocytter, runde via, og elongating via fra voksen mus testiklene bruker en usammenhengende storfe serum albumin tetthet gradient med standard laboratorieutstyr.
For å karakterisere hvert trinn av spermatogenesis, må forskerne skille forskjellige subpopulasjoner av bakterieceller fra testiklene. Imidlertid er isolere diskrete populasjoner utfordrende, fordi den voksne testikkel inneholder en kompleks blanding av bakterieceller fra alle trinn av spermatogenesis sammen med visse populasjoner av somatiske celler. I løpet av de siste ti årene, ulike teknikker som sentrifugal elutriation, fluorescens-aktivert celle sortering (FACS), og STA-PUT har blitt brukt til isolering av bakterieceller. En ulempe er at de alle krever dedikerte enheter og spesialisert trening. Følgende prinsipper underliggende STA-PUT metoden, en enkel protokoll har blitt utviklet for isolering av pachytene spermatocytter, runde via, og elongating via fra mus testiklene. Etter å ha forberedt en enkelt celle suspensjon av testikkel celler, er spesifikke celle populasjoner beriket av tyngdekraften sedimentering gjennom en usammenhengende storfe serum albumin (BSA) tetthet gradient. Celle fraksjoner blir deretter manuelt innsamlet og mikroskopisk analysert. Denne endrede tettheten gradient for runde via (MDR) sedimentering protokollen kan bli mye brukt, fordi det krever bare standard laboratorieutstyr. Videre krever protokollen minimalt med start materialer, og reduserer kostnadene og bruken av forsøksdyr.
Mye er fortsatt ukjent om den molekylære og biologiske hendelser som finner sted i løpet av pattedyr spermatogenesis, en kompleks prosess der spermatogonial stamceller forvandle seg til svært spesialiserte spermatozoa1,2. Spermatogenesis finner sted inne i sæd tubuli av testikkel. Tubuli inneholder en blanding av bakterieceller fra hvert trinn av differensiering, inkludert spermatogonial stamceller, mitotically dele spermatogoniene, meiotic spermatocytter, og postmeiotic via (som gjennomgår haploide differensiering fra runde via til elongating via, og til slutt å modne spermatozoa). Somatiske celler av testikkel inkluderer Sertoli celler som er blandet med bakterieceller inne i sæd tubuli, peritubular myoid celler som danner vegger av tubuli, og testosteron-produserende Leydig celler i interstitiell mellomrom mellom tubuli.
Studere molekylære og biokjemiske prosesser under spermatogenesis krever ofte separasjon av distinkte bakterie celle populasjoner fra en kompleks blanding av testikkel celler. Mange forskjellige strategier er utviklet for celle berikelse. De mest vellykkede metodene er sta-Put Velocity sedimentering av Unit Gravity3,4,5,6, sentrifugal elutriation basert på motstrøm sentrifugering7,8, og fluorescens celle sortering (FACS) som skiller celler i henhold til DNA-innhold og/eller spesifikke markører. Disse metodene er ofte brukt blant spermatogenesis forskere og gir mulighet for effektiv berikelse av spesifikke bakterie celletyper. Men en begrensning av disse teknikkene er at de krever spesialisert, kostbar maskinvare som krever ekspertise.
Presentert her er en enkel og rimelig protokoll for å isolere beriket bestander av de tre mest tallrike celle populasjoner av mus testiklene: runde via, pachytene spermatocytter, og elongating via. Denne protokollen er referert til som modifisert tetthet gradient for runde via (MDR), fordi det fungerer spesielt godt for berikende runde via. MDR-metoden er basert på de samme prinsippene som STA-PUT Velocity-sedimentering, men det krever bare standard laboratorieutstyr. Levende celler har lov til å sediment gjennom en manuelt forberedt usammenhengende storfe serum albumin (BSA) tetthet gradient i en standard 50 mL rør under jordens tyngdefelt. Større celler bevege seg raskere gjennom gradient, som skiller ulike populasjoner av bakterieceller. Etter sedimentering, er beriket brøkdeler av de tre celletyper manuelt samlet inn. Renheten av disse beriket celle populasjoner er sammenlignbare med de som oppnås ved STA-PUT og sentrifugal elutriation.
I tillegg til å dekke konstruksjonen og bruken av BSA-graderingen for hastighets sedimentering, beskriver protokollen også en fordøyelse metode for å frigi testikkel celler fra sæd tubuli. Protokollen ble modifisert fra den som ble utviklet av Romrell et al.9 og inkluderer sekvensiell digestions med kollagenase IV og Trypsin. Sekvensiell digestions kombinert med bruk av en bikarbonat buffer (dvs. den Krebs løsning) har vist til stor styrke separasjon og levedyktighet av Bakteriecellene9.
Under MDR berikelse, celler tilbringer rundt 4 h sammen utenfor miljøet av sæd tubuli og er ikke utsatt for stressende mekaniske krefter, som gjør det mulig for innsamling av svært levedyktig mobilnettet fraksjoner for nedstrøms analyse. I tillegg, i likhet med sentrifugal elutriation og STA-PUT, krever ikke MDR-protokollen noen kjemisk behandling eller merking av celler, noe som også bidrar til å opprettholde levedyktigheten. Viktigere, så lite som to voksen mus testiklene er tilstrekkelig for MDR isolasjon og derfor, en voksen mus gir nok beriket celler for både RNA og proteinanalyse. Standard STA-PUT-protokoll anbefaler bruk av så mange som 12 voksne mus for celle isolasjon6; Men, basert på tidligere erfaringer, er det kjent at vellykket isolasjon kan gjøres fra tre til fire voksne mus. Den laveste mengden av Start materiale rapportert å være tilstrekkelig for sentrifugal elutriation er seks mus testiklene (tre mus)8. Derfor, foruten å eliminere behovet for kostbart spesialisert utstyr, vil MDR-protokollen redusere antallet laboratoriedyr som kreves.
Presentert her er en enkel og rimelig protokoll for å isolere beriket populasjoner av runde via, pachytene spermatocytter, og elongating via bruker standard laboratorieutstyr (oversikt over protokollen som vises i Figur 4). Selv om ingen kompetanse eller dyre maskiner er nødvendig, er det noen kritiske skritt som må vurderes under vev fordøyelse, bygging av gradient, og lasting av cellen suspensjon på gradient.
Bakterieceller frigis fra sæd tubuli av to påfølgende enzymatisk digestions. Den første fordøyelsen med kollagenase IV skiller sæd tubuli ved å fjerne interstitiell celler. Forlenget fordøyelse tid kan skade tubuli og føre til tap av via, som (hvis den slippes fra tubuli under dette trinnet) de vil bli forkastet i følgende trinn. Den andre fordøyelsen trinn med Trypsin utgivelser bakterieceller fra sæd tubuli. Det kan være sporadisk cellelyse og typisk noen klumper form på grunn av utgitt genomisk DNA. Overstiger den foreslåtte varigheten eller temperaturen på fordøyelsen er ikke anbefalt, da dette kan føre til dårligere levedyktighet, økt cellelyse, og klumper. Hvis mild klumper forekommer, kan klumper ignoreres. Men i tilfeller av betydelig klumper og tap av celler, Trypsin fordøyelsen tid eller konsentrasjon bør reduseres. Det bør også bemerkes at enzymatisk aktivitet av Trypsin kan variere mellom partier og under lengre tider med lagring. Mengden av DNase jeg under Trypsin fordøyelsen kan også økes for å fjerne overflødig klumper, men dette bør betraktes som en sekundær løsning. Det er viktig å få en homogen enkelt celle suspensjon på slutten av pre-behandling, siden klumpet seg celler vil sediment raskere, forurensende fraksjoner og forstyrre gradient.
Bygge gradient kan kreve litt øvelse. Hvis det er ubehag ved hjelp av en 5 mL pipette med en pipette-kontroller, anbefales det å bruke en vanlig 1 mL mekanisk pipette med et jevnt stempel og deretter kutte pipette tips til en blenderåpning på ~ 3 mm i diameter (figur 1B). En bredere blenderåpning og jevn lasting av BSA-løsningene vil redusere risikoen for å blande graderingen. Når det er riktig forberedt, er det mulig å se grensene mellom tilstøtende BSA-løsninger på grunn av deres ulike brytnings indekser. Graderingen skal produseres direkte før bruk. Det bør også bemerkes at noen små risting eller vibrasjoner kan forstyrre gradient, så gradient bør settes i et miljø der det ikke vil bli forstyrret.
Lasting av cellen suspensjon på gradient må gjøres veldig nøye. Etter lasting, bør cellen suspensjonen holde på toppen av gradient, som cellene vil langsomt begynne å sediment gjennom det første laget. Hvis store grupper av celler blir sett beveger seg raskt gjennom gradient, var cellene sannsynligvis ikke resuspendert forsiktig eller det er overflødig klumper. Hvis cellene ikke holde på toppen av usammenhengende BSA gradient ved lasting, men umiddelbart synke mellom 1% og 2% BSA lag (trinn 3,6), er cellen suspensjonen trolig for tett. Denne protokollen er optimalisert ved hjelp av to testiklene av en voksen mus (80-120 mg/testikkel) som starter materiale; Selv om det er utført vellykkede isolasjoner med reduserte mengder Start materiale. For å oppskalere protokollen og få mer beriket bakterieceller fra høyere antall testiklene, mer 50 mL rør med gradient bør innføres.
Protokollen ble opprinnelig utviklet og optimalisert for å berike haploide runde via fra voksen mus testiklene, og renheten av runde spermatid fraksjoner er forventet å være mer enn 90%. I tillegg til svært ren runde spermatid fraksjoner, tilfredsstillende resultater for berikelse av pachytene spermatocytter og elongating via ble innhentet. Det bør bemerkes at erytrocytter kan forurense elongating spermatid fraksjoner, og ytterligere tiltak for å eliminere dem bør tas hvis deres tilstedeværelse er forventet å forstyrre nedstrøms analyser. Vi har ikke kunnet berike andre celletyper som premeiotic eller tidlige meiotic celler (før pachytene fase) fra voksne mus som bruker MDR-protokollen.
I tillegg STA-PUT sedimentering har blitt brukt til å skaffe beriket fraksjoner av spermatogoniene eller preleptotene, leptotene, og zygotene spermatocytter bruker juvenile testiklene samlet på gitte tidspunkter etter fødselen13. Denne tilnærmingen utnytter utseendet på disse celle typene under den første bølgen av spermatogenesis. Den samme tilnærmingen kan trolig brukes til MDR berikelse, men det har ennå ikke blitt testet i praksis. En annen metode som er et godt alternativ for rensing av premeiotic og meiotic celler på bestemte stadier av differensiering er FACS, som har den viktige fordelen av å tillate isolering av spesifikke celletyper basert på tilstedeværelsen spesifikke markører14 ,15,16,17.
Overall, fungerer MDR hastighet sedimentering som en nyttig metode for bakterie celle berikelse. Selv om denne metoden ikke er bedre enn andre veletablerte metoder i forhold til renhet eller mengde beriket celler, dens klare fordeler er dens enkelhet og lave sette opp kostnadene. Dette, sammen med den lave mengden av nødvendige starter materialer, gjengi denne protokollen et flott alternativ for forskere i spermatogenesis feltet og de i andre felt som kanskje ikke ønsker å investere i spesialisert maskinvare eller store grupper av dyr.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke alle Kotaja Lab medlemmer for deres bidrag under utviklingen av protokollen, og den aktive bruk og testing av protokollen i sine forskningsprosjekter. Spesielt vi setter pris på bidraget fra Jan Lindström for hjelp til å optimalisere protokollen. Denne studien ble støttet av Academy of Finland, Sigrid Jusélius Foundation, og Turku doktorgradsprogram for molekylær medisin.
4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
Dextrose | Preference of researcher | ||
DNase I | Worthington | LS006355 | |
GAPDH | HyTest | 5G4 | |
HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
KCl | Preference of researcher | ||
KH2PO4 | Preference of researcher | ||
MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
NaCl | Preference of researcher | ||
NaHCO3 | Preference of researcher | ||
NH4Cl | Preference of researcher | ||
Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
Trypsin | Worthington | LS003703 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1.5 mL or 2 ml tubes | Preference of researcher | ||
40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
cell culture incubator | Preference of researcher | ||
centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
microdissection scissors | Preference of researcher | ||
microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
tips for 1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
water bath | Preference of researcher | ||
widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |