القياس الضوئي متعدد ألياف لتسجيل النشاط العصبي في الكائنات المتحركة بحريه
Summary
هذا البروتوكول تفاصيل كيفيه تنفيذ وأداء التسجيلات الضوئية متعددة ألياف ، وكيفيه تصحيح للتحف المستقلة الكالسيوم ، والاعتبارات الهامه للتصوير الضوئي ثنائي اللون.
Abstract
تسجيل نشاط مجموعه من الخلايا العصبية في الحيوانية تتحرك بحريه هو مهمة صعبه. وعلاوة علي ذلك ، كما يتم تشريح الدماغ في المجموعات الفرعية الوظيفية أصغر وأصغر ، يصبح من الاهميه بمكان لتسجيل من الإسقاطات و/أو السكان الفرعيين المحددة وراثيا من الخلايا العصبية. ألياف الضوئية القياس هو نهج يمكن الوصول اليها وقويه التي يمكن التغلب علي هذه التحديات. من خلال الجمع بين المنهجيات البصرية والجينية ، يمكن قياس النشاط العصبي في هياكل الدماغ العميق عن طريق التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا ، والتي تترجم النشاط العصبي إلى اشاره بصريه يمكن قياسها بسهوله. ويفصل البروتوكول الحالي مكونات نظام القياس الضوئي متعدد ألياف ، وكيفيه الوصول إلى هياكل الدماغ العميقة لتقديم وجمع الضوء ، وطريقه لحساب القطع الاثريه الحركية ، وكيفيه معالجه وتحليل إشارات الفلورسنت. ويفصل البروتوكول الاعتبارات التجريبية عند اجراء التصوير بألوان الاحاديه أو المزدوجة ، سواء من ألياف بصريه مزروعة واحده أو متعددة.
Introduction
القدرة علي ربط الاستجابات العصبية مع جوانب محدده من سلوك الحيوانية أمر بالغ الاهميه لفهم دور مجموعه معينه من الخلايا العصبية يلعب في توجيه أو الاستجابة لعمل أو التحفيز. نظرا لتعقيد السلوك الحيواني ، مع عدد لا يحصي من الدول الداخلية والمحفزات الخارجية التي يمكن ان تؤثر حتى ابسط الإجراءات ، وتسجيل اشاره مع قرار واحد المحاكمة يزود الباحثين مع الاداات اللازمة للتغلب علي هذه القيود.
أصبحت ألياف الضوئية تقنيه الاختيار للعديد من الباحثين في مجال علم الأعصاب نظم بسبب بساطتها النسبية مقارنه بغيرها من تقنيات التسجيل المجرية ، وارتفاع نسبه الاشاره إلى الضوضاء ، والقدرة علي تسجيل في مجموعه متنوعة من النماذج السلوكية1،2،3،4،5،6،7،8. وخلافا للأساليب الكهربائية الكهربية التقليدية ، فان القياس الضوئي هو النهج البصري الأكثر استخداما بالاقتران مع مؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا (جيكسيس ، سلسله GCaMP)9. وتقوم اليتالق بتغيير قدرتها علي الاعتماد علي ما إذا كانت مرتبطة بالكالسيوم ام لا. لان التركيز الداخلي للكالسيوم في الخلايا العصبية هو منظم باحكام وقناات الكالسيوم الجهد بوابات مفتوحة عندما حرائق الخلايا العصبية المحتملة العمل ، وزيادات عابره في تركيز الكالسيوم الداخلي ، مما يؤدي إلى زيادات عابره في يمكن للقدرة علي الفلورية إلى مضان ، يمكن ان يكون وكيلا جيدا لإطلاق النار العصبية9.
مع ألياف الضوئية ، يتم توجيه ضوء الاثاره أسفل رقيقه ، وألياف البصرية مولتيمود في الدماغ ، ويتم جمع اشاره الانبعاثات النسخ الاحتياطي من خلال نفس ألياف. لان هذه ألياف البصرية خفيفه الوزن وانحناء ، يمكن للحيوان ان يتحرك إلى حد كبير دون عوائق ، مما يجعل هذه التقنية متوافقة مع مجموعه واسعه من الاختبارات والظروف السلوكية. بعض الظروف ، مثل الحركات السريعة أو الانحناء من ألياف البصرية الحبل التصحيح خارج دائره نصف قطرها التي يمكن ان تحافظ علي الانعكاس الداخلي الكلي ، يمكن إدخال التحف اشاره. لغموض عن اشاره من الضجيج ، يمكننا استغلال ممتلكات GCaMP المعروفة باسم “نقطه isosbestic.” بإيجاز, مع [غكمب], بما ان الطول موجي من الاثاره ضوء يكون غيرت إلى اليسار, انبعاثاته في ال [كلسيوم-فيف] دوله تناقصات والاذاعه في الدولة [كلسيوم-اونبد] زيادات هامشيا. والنقطة التي تكون فيها الكثافة النسبية لهذين النوعين من الانبعاثات متساوية تسمي النقطة الايزوبيتيك. عندما يكون GCaMP متحمسا في هذه المرحلة ، فان انبعاثاته لا تتاثر بالتغيرات في تركيزات الكالسيوم الداخلية ، وغالبا ما يكون التباين في الاشاره بسبب توهين الاشاره من الانحناء الزائد لحبل التصحيح بألياف البصرية أو حركه الانسجه العصبية بالنسبة للألياف المزروعة.
وحده واحده من فسيولوجيا الكهربائية لا يزال معيار الذهب للتحرك بحريه في التسجيلات المجرية بسبب الخلية واحده والقرار مستوي واحد سبايك. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تحديد الهوية الجزيئية للخلايا التي يتم تسجيلها ، ويمكن ان يكون التحليل اللاحق لذلك شاقا للغاية. بينما ألياف الضوئية ليس لديها دقه خليه واحده ، فانه يسمح للباحثين لطرح الاسئله من المستحيل معالجه مع التقنيات التقليدية. الجمع بين الاستراتيجيات الفيروسية مع الكائنات المحورة وراثيا ، يمكن توجيه التعبير عن جيكليس إلى أنواع الخلايا العصبية المحددة وراثيا لتسجيل النشاط العصبي المحدد للسكان أو الإسقاط ، والذي يمكن تنفيذه عن طريق مراقبه اشاره الكالسيوم مباشره في محور عصبي انتهائيه10,11. وعلاوة علي ذلك ، من خلال زرع العديد من ألياف البصرية ، فمن الممكن لمراقبه النشاط العصبي في وقت واحد من عده مناطق الدماغ ومسارات في نفس الحيوانية12،13.
في هذه المخطوطة ، نقوم بوصف تقنيه لقياس الضوء الأحادي ومتعدد ألياف ، وكيفيه تصحيح القطع الاثريه المستقلة عن الكالسيوم ، وتفاصيل كيفيه اجراء تسجيلات أحاديه اللون ومزدوجة ألوان. كما نقدم أمثله علي أنواع الاسئله التي تمكن المرء من طرحها ومستوياتها المتزايدة من التعقيد (انظر الشكل 1). ويمكن بناء الاعداد الضوئي ألياف للتسجيلات متعددة ألياف مفصله في هذا البروتوكول باستخدام قائمه من المواد الموجودة في https://sites.google.com/view/multifp/hardware (الشكل 2).
فمن الضروري ان تكون مجهزه للنظام لكل من 410 nm و 470 nm الاثاره الموجات للانبعاثات الكالسيوم مستقله والكالسيوم المعتمدة من GCaMP6 أو المتغيرات لها. للاجهزه التي بنيت خصيصا أو إذا كان هناك اي برنامج متاح لتشغيل النظام ، ويمكن استخدام البرنامج المفتوح المصدر الحرة بونساي (http://www.open-ephys.org/bonsai/). بدلا من ذلك ، يمكن تشغيل ألياف الضوئية من خلال MATLAB (علي سبيل المثال ، https://github.com/deisseroth-lab/multifiber)12 أو غيرها من لغة البرمجة14. وينبغي ان البرمجيات والاجهزه من النظام تسمح التلاعب في كل من 410 nm و 470 nm المصابيح والكاميرا ، واستخراج الصور (الشكل 2) ، وحساب كثافة الفلورسنت يعني في مناطق الاهتمام (rois) رسمها حول ألياف علي الصور. يجب ان يكون الإخراج جدول قيم كثافة متوسط سجلت مع 470 nm و 410 nm المصابيح من كل ألياف في الحبل التصحيح. عند اجراء التجارب متعددة ألياف ، 400 μm ألياف المجمعة قد تحد من حركه الفئران. في مثل هذه الحالات ، نوصي باستخدام الحبال التصحيح 200 μm ، والتي توفر المزيد من المرونة. قد يكون من الممكن أيضا استخدام أصغر الكابلات وهميه اثناء تدريب الفئران.
ومن الاهميه بمكان ان تكون قادره علي استخراج النقاط الزمنيه للاحداث المثيرة للاهتمام اثناء اكتساب ألياف الضوئية. إذا لم يوفر النظام بسهوله نظام مدمج لدمج TTLs لاحداث محدده ، فان الاستراتيجية البديلة هي تعيين طابع زمني للنقاط الزمنيه الفردية المسجلة لتتماشي مع الأوقات والاحداث المحددة اثناء التجربة. ويمكن القيام به ختم الوقت باستخدام ساعة الكمبيوتر.
Protocol
Representative Results
Discussion
ألياف الضوئية القياس هو نهج يمكن الوصول اليها التي تسمح للباحثين لتسجيل ديناميات الكالسيوم السائبة من السكان الخلايا العصبية المحددة في الحيوانية تتحرك بحريه. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة مع مجموعه واسعه من الاختبارات السلوكية, بما في ذلك “حركه ثقيله” المهام مثل اختبارات السباحة القسري<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC: RGPIN-2017-06131) إلى C.P. c. P. هو FRSQ Chercheur-Boursier. كما نشكر الhttps://www.neurophotonics.ca/fr/pom التي استخدمت في هذه الدراسة لإنتاج النواقل الفيروسية المستخدمة فيها.
Materials
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1" Long | Thorlabs | SH25S100 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 1/2" Long | Thorlabs | SH25S050 | |
| 1/4"-20 Stainless Steel Cap Screw, 3/8" Long | Thorlabs | SH25S038 | |
| 1000 µm, 0.50 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs | M59L01 | |
| 12.7 mm Optical Post | Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm Pedestal Post Holder | Thorlabs | PH20EM | |
| 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for T-Cube | Thorlabs | KPS101 | |
| 20x objective | Thorlabs | RMS20X | #10 in Figure 2, #11 in Figure 5 |
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs | CM1-DCH/M | #8-9 in Figure 2, #8-10 in Figure 5 |
| 405 nm LED | Doric Lenses | CLED_405 | #2 in Figure 2 |
| 410 nm bandpass filter | Thorlabs | FB410-10 | #5 in Figure 2; #7 in Figure 5 |
| 465 nm. LED | Doric Lenses | CLED_465 | #1 in Figure 2 |
| 470 nm bandpass filter | Thorlabs | FB470-10 | #4 in Figure 2; #6 in Figure 5 |
| 560 nm bandpass filter | Semrock | FF01-560/14-25 | #5 in Figure 5 |
| 560 nm LED | Doric Lenses | CLED_560 | #1 in Figure 3 |
| 5-axis kinematic Mount | Thorlabs | K5X1 | #11 in Figure 2, #12 in Figure 5 |
| Achromatic Doublet | Thorlabs | AC254-035-A-ML | #7 in Figure 2 |
| Adaptor for 405 collimator | Thorlabs | AD11F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Adaptor for ajustable collimator | Thorlabs | AD127-F | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Aluminum Breadboard | Thorlabs | MB1824 | |
| Clamping Fork | Thorlabs | CF125 | |
| Cube connector | Thorlabs | CM1-CC | |
| Dual 493/574 dichroic | Semrock | FF493/574-Di01-25×36 | #10 in Figure 5 |
| Emission filter for GCaMP6 | Semrock | FF01-535/22-25 | #6 in Figure 2 |
| Enclosure with Black Hardboard Panels | Thorlabs | XE25C9 | |
| Externally SM1-Threaded End Cap for Machining | Thorlabs | SM1CP2M | |
| Fast-change SM1 Lens Tube Filter Holder | Thorlabs | SM1QP | #4-6 in Figure 2, #5-7 in Figure 5 |
| Fixed Collimator for 405 nm light | Thorlabs | F671SMA-405 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Fixed collimator for 470 and 560 nm light | Thorlabs | F240SMA-532 | #3 in Figure 2; #4 in Figure 5 |
| Green emission filter | Semrock | FF01-520/35-25 | In light beam splitter |
| High-Resolution USB 3.0 CMOS Camera | Thorlabs | DCC3260M | #13 in Figure 2, #15 in Figure 5 |
| Light beam splitter | Neurophotometrics | SPLIT | #14 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 425 nm Cutoff | Thorlabs | DMLP425R | #8 in Figure 2, #9 in Figure 5 |
| Longpass Dichroic Mirror, 495 nm Cutoff | Semrock | FF495-Di03 | #9 in Figure 2, #8 in Figure 5 |
| Metabond dental cement | C&B | ||
| M8 – M8 cable | Doric Lenses | Cable_M8-M8 | |
| Optic fiber cannulas | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Optic fiber Patchcords | Doric Lenses | Need to specify that these will be used to photometry experiments requiring low autofluorescence | |
| Red emission filter | Semrock | FF01-600/37-25 | In light beam splitter |
| T7 LabJack | LabJack | ||
| T-cube LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
| USB 3.0 I/O Cable, Hirose 25, for DCC3240 | Thorlabs | CAB-DCU-T3 |
References
- Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
- Proulx, C. D., et al. A neural pathway controlling motivation to exert effort. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (22), 5792-5797 (2018).
- Muir, J., et al. In Vivo Fiber Photometry Reveals Signature of Future Stress Susceptibility in Nucleus Accumbens. Neuropsychopharmacology. 43 (2), 255-263 (2017).
- Wang, D., et al. Learning shapes the aversion and reward responses of lateral habenula neurons. eLife. 6, (2017).
- de Jong, J. W., et al. A Neural Circuit Mechanism for Encoding Aversive Stimuli in the Mesolimbic Dopamine System. Neuron. 101 (1), 133-151 (2018).
- Lerner, T. N., et al. Intact-Brain Analyses Reveal Distinct Information Carried by SNc Dopamine Subcircuits. Cell. 162 (3), 635-647 (2015).
- Calipari, E. S., et al. In vivo imaging identifies temporal signature of D1 and D2 medium spiny neurons in cocaine reward. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2726-2731 (2016).
- González, A. J., et al. Inhibitory Interplay between Orexin Neurons and Eating. Current Biology. 26 (18), 2486-2491 (2016).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Siciliano, C. A., Tye, K. M. Leveraging calcium imaging to illuminate circuit dysfunction in addiction. Alcohol. 74, 47-63 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
- Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
- Akam, T., Walton, M. E. pyPhotometry: Open source Python based hardware and software for fiber photometry data acquisition. Scientific Reports. 9 (1), 3521 (2019).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7 (1), 12-23 (2011).
- Stamatakis, A. M., et al. Lateral Hypothalamic Area Glutamatergic Neurons and Their Projections to the Lateral Habenula Regulate Feeding and Reward. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 302-311 (2016).
- Tervo, G. D., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Yu, K., da Silva, P., Albeanu, D. F., Li, B. Central Amygdala Somatostatin Neurons Gate Passive and Active Defensive Behaviors. The Journal of Neuroscience. 36 (24), 6488-6496 (2016).
- Falkner, A. L., Grosenick, L., Davidson, T. J., Deisseroth, K., Lin, D. Hypothalamic control of male aggression-seeking behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 596-604 (2016).
- Ren, J., et al. Anatomically Defined and Functionally Distinct Dorsal Raphe Serotonin Sub-systems. Cell. 175 (2), 472-487 (2018).
- Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLOS ONE. 12 (2), 0170934 (2017).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), (2018).
- Feng, J., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Detection of Norepinephrine. Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).
- Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
- Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Current Opinion in Neurobiology. 50, 171-178 (2018).
- Lu, L., et al. Wireless optoelectronic photometers for monitoring neuronal dynamics in the deep brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1374-1383 (2018).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing Hypothalamic Network Dynamics for Appetitive and Consummatory Behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2014).
