Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi
Summary
Bu protokol, meyve sineği metamorfoza uğrarken Drosophila abdominal epitelde hücre oryantasyonu ve doku büyüme dinamiklerinin görüntülenmesi ve analizi için tasarlanmıştır. Burada açıklanan metodoloji Drosophila veya diğer model organizmalarda farklı gelişimsel aşamaların, dokuların ve hücre altı yapıların incelenmesine uygulanabilir.
Abstract
Çok hücreli organizmalar içinde, olgun doku lar ve organlar kurucu hücrelerinin mekansal düzenlemelerinde yüksek derecede düzen gösterirler. Dikkat çekici bir örnek duyusal epitel tarafından verilir, aynı veya farklı kimlikleri nhücreleri son derece organize düzlemsel desenler gösteren hücre-hücre adezyonu ile bir araya getirilir. Hücreler birbirlerine aynı yönde hizalanır ve büyük mesafelerde eşdeğer polarite görüntüler. Olgun epitelin bu organizasyonu morfogenez boyunca kurulmuştur. Olgun epitelin düzlemsel düzenlemesinin nasıl sağlandığını anlamak için, in vivo gelişimi sırasında hücre oryantasyonve büyüme dinamiklerini yüksek spatiotemporal sadakatle izlemek çok önemlidir. Yerelden küresele geçişleri tanımlamak ve tanımlamak için sağlam analitik araçlar da gereklidir. Drosophila pupa epitel morfogenez altında yatan yönelimli hücre şekli değişiklikleri değerlendirmek için ideal bir sistemdir. Pupal gelişen epitel hareketsiz vücudun dış yüzeyini oluşturur, bozulmamış hayvanların uzun süreli görüntülenmesi sağlar. Burada açıklanan protokol, büyüdükçe pupal abdominal epidermiste hem küresel hem de lokal düzeyde hücre davranışlarını görüntülemek ve analiz etmek için tasarlanmıştır. Açıklanan metodoloji, diğer gelişim evrelerinde, dokularda, hücre altı yapılarda veya model organizmalarda hücre davranışlarının görüntülenmesine kolayca adapte edilebilir.
Introduction
Rollerini başarmak için, epitel dokular tamamen hücresel bileşenlerinin mekansal organizasyon güveniyor. Epitelin çoğunda hücreler sadece kesin bir parke taşı tabakası oluşturmak için birbirlerine karşı paketlenmezler, aynı zamanda vücut eksenlerine göre kendilerini yönlendirirler.
Omurgalı iç kulak ve retina gibi duyusal epitelde hassas doku organizasyonunun fonksiyonel önemi açıktır. İlk durumda, saç ve destekleyici hücreler ses ve hareket1gibi mekanik girdileri verimli bir şekilde algılamak için belirli bir eksenel yönde hizalamak1 ,2. Benzer şekilde, fotoreseptör hücre mekansal organizasyonretina3 tarafından optimum optik özellikleri elde etmek için gereklidir. Hücre pozisyonu ve oryantasyonuz mekansal kontrolü böylece uygun fizyolojik fonksiyon için özel bir alaka olduğunu.
Drosophila, larva vücut yapılarının metamorfoz yoluyla tamamen dönüşümüne neden olan ve erişkin dokularına yol açan holometabolöz bir böcektir. Drosophila pupa dinamik olayların çeşitli noninvaziv canlı görüntüleme için mükemmel bir modeldir, gelişimsel hücre göçü dahil4, hücre bölünmesi ve büyüme dinamikleri5, kas kasılması6, hücre ölümü7, yara onarımı 8, ve hücre oryantasyonu9. Yetişkin Drosophilaolarak , dış epitel sipariş yüksek derecede gösterir. Bu kolayca trichomes düzenlemeleri gözlenir (yani, tek epitel hücrelerinden kaynaklanan hücre çıkıntıları) ve duyusal kıllar sinek vücut yüzeyinde10. Nitekim, trichomes paralel satırlar hava akımı11rehberlik hizalanır. Erişkin epitelinin morfogenezi ve tek tek hücrelerin düzenli düzenlenmesi embriyogenez sırasında başlar ve pupal evrelerinde doruğa ulaşır. Embriyolarda hücre bölünmeleri, intercalations, ve şekil değişiklikleri tüm doku düzeni azaltmakiken 12,13, Bu gelişmenin daha sonraki aşamalarında geri, özellikle pupal aşamalarında, sinek olgunluğa yaklaştığında9.
Hareketsiz Drosophila pupa hücre şekli ve oryantasyon değişiklikleri değerlendirmek için ideal bir sistem sağlar. Pupal abdominal epidermis özel avantajlar sunar. Yetişkin baş öncüleri, toraks, genital, ve uzantıları büyümek ve larva aşamalarından desenli olsun iken, larva epidermis entegre histoblastlar, büyüyen başlar ve sadece pupariation farklılaşma14. Bu özellik, doku düzeninin kurulmasında rol oynayan tüm spatiotemporal olayların tümünün izlenmesine olanak sağlar9.
Histoblastlar her varsayımsal abdominal segmentte kontralateral pozisyonlarda embriyonik gelişim sırasında belirtilir. Erişkin dorsal abdominal epidermis dorsolaterally anterior ve posterior bölmeleri mevcut histoblast yuvaları bulunan türetilmiştir15,16. Histoblastlar genişledikçe, larva epitel hücreleri (LECs) yerine, konfluent levha oluşturan dorsal orta hat kontralateral yuvaları sigorta17,18,19,20.
Bu çalışma 1) Drosophila pupa diseksiyon, montaj ve uzun vadeli canlı görüntüleme için bir metodoloji açıklar, ve 2) yüksek spatiotemporal çözünürlükte hücresel oryantasyon ve büyüme dinamiklerini incelemek için analitik yöntemler. Burada, ilk pupa hazırlığından (evreleme ve görüntüleme) yönlülük ve oryantasyon özelliklerinin çıkarılması ve ölçülmesi için gerekli tüm adımları kapsayan ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Ayrıca hücre klonları analizinden yerel doku özelliklerini nasıl çıkarabileceğimizi de açıklıyoruz. Açıklanan tüm adımlar minimal invazivdir ve uzun süreli canlı analizlere olanak sağlar. Burada açıklanan yöntemler kolayca adapte edilebilir ve diğer gelişim evrelerine, dokulara veya model organizmalara uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uzun menzilli düzen en fonksiyonel fizyolojik birimlerin temel bir özelliğidir. Morfogenez sırasında, yüksek zamansal ve mekansal hassasiyetle uygulanan karmaşık talimatların entegrasyonu ile düzen elde edilir. Çoklu ve çok düzeyli konsuşlar stereotipli doku düzenlemelerine entegre edilmiştir.
Polarite ve yönlülük gelişim sırasında düzenli mekansal düzenleme için çok önemlidir. Polarite gelişme sırasında simetri kırılması anlamına gelir. Embriyonik anteroposte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Martín-Blanco laboratuvarı üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Ayrıca Nic Tapon (Crick Enstitüsü, Londra, İngiltere), Bloomington Stock Center (University of Indiana, ABD) ve FlyBase (Drosophila gen ek gösterimi için) teşekkür ederiz. Federica Mangione JAE-CSIC doktora öncesi bursu ile desteklendi. Martín-Blanco laboratuvarı Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P ve BFU2017-82876-P) ve Fundación Ramón Areces tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
References
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Developmental Biology. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Developmental Biology. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, 41-60 (1988).
