Wir beschreiben ein Protokoll zur zelltypspezifischen Expression des genetisch codierten FRET-basierten Sensors ATeam1.03YEMK in organotypischen Scheibenkulturen des Mausvorhirns. Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Sensor für die dynamische Bildgebung von zellulären ATP-Spiegeln in Neuronen und Astrozyten verwendet wird.
Die neuronale Aktivität im Zentralnervensystem (ZNS) weckt eine hohe Nachfrage nach zellulärer Energie, die durch den Abbau von Adenosintriphosphat (ATP) entsproche. Ein großer Teil von ATP wird benötigt, um Ionengradienten über Plasmamembranen, die durch elektrische Signalisierung von Neuronen abgebaut werden, neu zu installieren. Es gibt Hinweise darauf, dass Astrozyten – während sie selbst keine schnellen elektrischen Signale erzeugen – eine erhöhte Produktion von ATP als Reaktion auf neuronale Aktivität durchlaufen und aktive Neuronen unterstützen, indem sie ihnen Energiemetaboliten zur Verfügung stellen. Die jüngste Entwicklung genetisch kodierter Sensoren für verschiedene Metaboliten ermöglicht nun die Untersuchung solcher metabolischen Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Astrozyten. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur zelltypspezifischen Expression des ATP-empfindlichen Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragungssensors (FRET-) Sensor ATeam1.03YEMK in organotypischen Gewebescheibenkulturen des Maus-Hippocampus und des Kortex mit adeno-assoziierten viralen Vektoren (AAV). Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Sensor zur dynamischen Messung von Veränderungen der zellulären ATP-Spiegel in Neuronen und Astrozyten bei Zunahmen des extrazellulären Kaliums und nach Induktion chemischer Ischämie (d. h. einer Hemmung des zellulären Energiestoffwechsels) eingesetzt werden kann.
Die exzitatorische elektrische Aktivität von Neuronen basiert weitgehend auf dem Fluss von Kationen wie Natrium (Na+) und Kalium (K+) über ihre Plasmamembranen. Die Aufrechterhaltung der elektrochemischen Gradienten dieser beiden Ionen ist daher für die Signalisierung erforderlich. Dies wird durch die zelluläre Na+/K+-ATPase (NKA) erreicht, eine allgegenwärtig exprimierte elektrogene Transmembranpumpe, die 3 Na+ aus der Zelle im Austausch für 2 K+ aus dem extrazellulären Raum extrudiert, was den Verbrauch eines Moleküls ATP pro Transportzyklus1erfordert. Neben dem NKA gibt es noch einige weitere ATP-verbrauchende Ionentransporter, darunter die Plasmamembran Ca2+-ATPase, die für die intrazelluläre Ca2+ Homöostase und deren Export nach aktivitätsinduziertem Zustrom2von entscheidender Bedeutung ist. In präsynaptischen Vesikeln erzeugt ein Vakuolar-Typ H+-ATPase (v-ATPase) den Protonengradienten, der für die Aufnahme des Neurotransmitters in dieses Fach erforderlich ist3.
Während die Aktivität von Neuronen daher eine erhebliche Menge an ATP4erfordert, weisen sie keine signifikante Kapazität für die Speicherung von Energie auf. Stattdessen scheinen sie auf metabolische Wechselwirkungen mit benachbarten Astrozyten zu verlassen, die wichtigsten Glykogenspeicher im Gehirn5. Es wurde vorgeschlagen, dass astrozytisches Glykogen in der Tat eine wichtige Rolle bei der Unterstützung des neuronalen Energiebedarfs spielt; und ein Schlüsselphänomen in dieser vorgeschlagenen neurometabolischen Kopplung zwischen den beiden Zelltypen ist die Fähigkeit der Astrozyten, ihre ATP-Produktion als Reaktion auf neuronale Aktivität zu erhöhen6,7,8. Diese Hypothese, bekannt als Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttle (ANLS), ist immer noch in der Debatte, weil andere Arbeiten Beweise dafür geliefert haben, dass Neuronen auch ihre eigene Rate der Glykolyse als Reaktion auf Stimulation9,10erhöhen können, was die Notwendigkeit weiterer Methoden und Ansätze zur Untersuchung der Neuro-Glia-Interaktion widerspiegelt.
Die Untersuchung des zellulären Energiestoffwechsels und des ATP-Spiegels in Neuronen und Astrozyten zur Aufklärung neuro-gliametabolischer Wechselwirkungen wird seit langem durch das Fehlen geeigneter Sonden zum Nachweis von Veränderungen der Metabolitenkonzentrationen in lebenden Zellen im Hirngewebe behindert. Das letzte Jahrzehnt hat jedoch einen Schub in der Entwicklung neuer Werkzeuge und neuer genetisch kodierter Fluoreszenzsonden für verschiedene Metaboliten, einschließlich Sensoren für ATP, Laktat, Pyruvat und andere11,12. Mit diesen Werkzeugen ist es nun möglich, Fragen im Zusammenhang mit dem zellulären ATP-Verbrauch und Veränderungen der zellulären Energieniveaus auf Einzelzellebene und zelltypspezifisch in intaktem Hirngewebe direkt zu behandeln13.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung der zytosolischen ATP-Dynamik auf Neuronen und Astrozyten kultivierter organotypischer Gehirnscheiben. Wir zeigen, wie adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) für die zelltypspezifische Expression des genetisch kodierten ATP-Nanosensors ATeam1.03YEMK (14) in Neuronen und Astrozyten von Scheiben des Maushirns verwendet werden, die in der Zellkultur für mehrere Wochen gehalten werden können15. Es wird ein Verfahren beschrieben, wie die Glianarbe entfernt wird, die kultivierte Gewebescheiben bedeckt, was die optische Zugänglichkeit und Bildgebung von Zellen in den darunter liegenden organotypischen Gewebeschichten verbessert. Schließlich zeigen wir, wie ATeam1.03YEMK verwendet werden kann, um FRET-basierte Abbildungvonen von Veränderungen in zellulären ATP-Spiegeln in dieser Zubereitung durchzuführen. Diese Methode hostet die wichtigsten Vorteile, dass es keine chirurgischen Gehirnverfahren erfordert, bietet hohe Expression der Sensor- und Zelltyp-Spezifität in kultivierten Gehirnscheiben, Verringerung der Invasivität oder Stress in den Zellen im Vergleich zu anderen Methoden, wie Transfektion durch Elektroporation oder Transduktion mit anderen viralen Vektoren10,16,17. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf andere FRET-basierte Nanosensoren angewendet werden, darunter Varianten von ATeam1.03, die eine geringere Bindungsaffinität für ATP14bieten.
Hier zeigen wir ein Verfahren zur zelltypspezifischen Expression von ATeam1.03YEMK, einem FRET-basierten, genetisch kodierten Nanosensor14, zur Messung von Veränderungen der ATP-Spiegel in Astrozyten oder Neuronen in organotypischen Gewebescheibenkulturen des Maushirns15. In beispielhaften Aufnahmen zeigen wir, dass eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration nicht zu einer Veränderung der ATP-Konzentrationen in Neuronen führt, während die astrozytischen ATP-Spiegel als Reaktion auf diese Manipulation steigen. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass bei Hemmung des Zellstoffwechsels das ATeam1.03YEMK FRET-Verhältnis bei beiden Zelltypen rapide abnimmt, was auf eine schnelle Abnahme des intrazellulären ATP hindeutet.
Die Expression von ATeam1.03YEMK in organotypischen Scheibenkulturen erfordert die Erhaltung des Gewebes in der Kultur unter kontrollierten Bedingungen für mindestens 7-10 Tage. Alternativ kann ATeam1.03YEMK auch zur Messung von ATP in akut isolierten Hirngewebescheiben und in Sehnerven von Mäusen13,15eingesetzt werden. Messungen in akut isoliertem Gewebe erfordern jedoch die Erzeugung transgener Tiere oder eine stereotaktische Anwendung viraler Vektoren in das Gehirn, die Tierversuche und strenge Tierpflegeprotokolle beinhalten. In dieser Hinsicht stellt die ATeam1.03YEMK-Expression in organotypischen Gewebescheibenkulturen eine nützliche und wertvolle Alternative22,23dar. Seit vielen Jahren dienen organotypische Gewebescheibenkulturen als etabliertes Modellsystem zur Untersuchung neuronaler Eigenschaften, Konnektivität und Entwicklung24,25,26. Sie erhalten nicht nur die allgemeine Gewebearchitektur und Laminierung (Abbildung 1), sondern beherbergen auch die bevorzugten Eigenschaften von Zellkulturen wie überlegene Zugänglichkeit und direkte Kontrolle experimenteller Bedingungen. Organotypische Gewebescheibenkulturen werden auch routinemäßig verwendet, um fremde Gene mit viralen Vektoren auszudrücken27. Mehrere Arten von viralen Vektoren wurden berichtet, transgenes in Gehirngewebe zu liefern16,28. Adenovirale Vektoren induzieren eine hohe Expression in Gliazellen, aber nicht Hippocampus-Neuronen16, und könnte gliare Reaktivität erzeugen17. Adeno-assoziierte virale Vektoren, wie hier verwendet, erscheinen als eine gute Alternative15, und ihre Wirksamkeit wurde auch in vivo29gezeigt.
Während vor allem für die Untersuchung der neuronalen Eigenschaften verwendet, neuere Studien haben festgestellt, dass organotypische Gewebe-Scheibenkulturen auch für die Analyse von Astrozyten verwendet werden können. Kultivierte Scheiben werden in der Regel von einer Schicht reaktiver Astrozyten19,30 (Abbildung 5) abgedeckt, aber Astrozyten zeigen eine nativere, nicht-reaktive Morphologie und Zytoarchitektur in tieferen Schichten19,30 (Abbildung 5). In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Verfahren zur mechanischen Entfernung der äußeren Glianarbe, das zu einer besseren experimentellen und optischen Zugänglichkeit einheimischer Astrozyten innerhalb der richtigen organotypischen Gewebeschichten führt. Darüber hinaus verbessert seine Entfernung die Expression Wirksamkeit in tieferen Schichten der organotypischen Scheiben; Wenn die Glianarbe nicht entfernt wird, kann die Transduktion durch AAVs auf die oberflächlichen Zellschichten beschränkt sein.
Bei der Durchführung von Experimenten in Gewebescheiben müssen mehrere externe mechanische Faktoren berücksichtigt werden. Eine Variation der Durchblutungsgeschwindigkeit des Bades kann Bewegungen der gesamten Zubereitung auslösen und/oder Fokusänderungen auslösen, was zu künstlichen transienten Veränderungen des Sensorsignals führt. Darüber hinaus wurden sowohl Astrozyten als auch Neuronen berichtet, um auf mechanische Verformungen zu reagieren, wie durch hohe Perfusionsratenauferlegt 32,33. In unseren Händen führt die Verwendung einer zuverlässigen Peristaltikpumpe zusammen mit der Aufrechterhaltung kleiner und stabiler Mengen an Saline zwischen Gewebe und Ziel (Meniskus) zu einem stabilen FRET-Signal unter Ausgangsbedingungen bei der hier verwendeten Perfusionsgeschwindigkeit (1,5-2,5 ml/min; Abbildung 8).
In der vorliegenden Studie zeigen wir auch, dass FRET-basierte Bildgebung mit ATeam1.03YEMK zur Überwachung des ATP-Spiegels in Neuronen und Astrozyten eingesetzt werden kann. Ein alternatives Mittel, das früher für die Messung der zellulären ATP eingeführt wurde, ist der sogenannte Luziferin-Luziferase-Assay34,35,36,37. Dieser Ansatz basiert jedoch auf der Abbildung der Biolumineszenz und bietet nur eine eher geringe zeitliche und räumliche Auflösung, teilweise aufgrund hoher Hintergrundgeräusche. Eine weitere Methode, die in den letzten Jahren routinemäßig angewandt wurde, war die Abbildung von Veränderungen der intrazellulären Magnesiumkonzentration mit dem ionenempfindlichen Fluorophor Magnesium grün38,39,40. Dieser Ansatz bezieht sich auf die Beobachtung, dass ein ATP-Verbrauch zur Freisetzung seines Co-Faktors Magnesium führt. Die Bildgebung mit Magnesiumgrün liefert dabei nur eine sekundäre Schätzung der Veränderungen der ATP-Werte. Darüber hinaus ist Magnesiumgrün auch empfindlich gegenüber Veränderungen des intrazellulären Kalziums, was eine weitere Schwierigkeit bei der Interpretation der mit dieser Methode erzielten Ergebnisse einführt.
Die jüngste Entwicklung von genetisch kodierten Nanosensoren zur direkten Bildgebung zellulärer Metaboliten stellte daher einen großen Schritt nach vorn dar11,12. Es wurden verschiedene Sensoren erzeugt, die zur Messung von intrazellulären ATP36,41,42,43eingesetzt werden können. Dazu gehören der ratiometrische fluoreszierende ATP-Indikator “QUEEN”41 sowie PercevalHR, der das ATP:ADP-Verhältnis42erkennt. Die letztgenannte Sonde ist zwar ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung des Energiestatus von Zellen, erfordert aber eine gleichzeitige Messung von Veränderungen des pH42.
ATeam ist ein Nanosensor, von dem es mehrere Varianten gibt, die sich unter anderem in ihrer Bindungsaffinität zu ATP14unterscheiden. In vitro weist ATeam1.03YEMK ein Kd von 1,2 mM bei 37 °C auf, das in der Nähe von zellulären ATP-Spiegeln liegt, die in verschiedenen neuronalen Zelltypen bestimmt sind und von Hypothalamus und Kleinhirn34 bis Hippocampus37,44,45. Bei Küvettenmessungen führte die Senkung der Temperatur um 10 °C zu einer signifikanten Abnahme der Bindungsaffinität von ATeam1.03YEMK zu ATP, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise nicht ideal für die zelluläre Bildgebung bei Raumtemperatur14ist. Unsere frühere Studie15zeigte jedoch, dass das Verhalten und die Reaktion von ATeam1.03YEMK, ausgedrückt in Neuronen und Astrozyten, bei verschiedenen Manipulationen bei nahezu physiologischen und Raumtemperatur ähnlich ist, was darauf hindeutet, dass der Sensor eine zuverlässige Bestimmung der intrazellulären ATP-Spiegel unter beiden Bedingungen ermöglicht. Darüber hinaus befassten sich unsere früheren Experimente mit der pH-Empfindlichkeit von ATeam1.03YEMK in Zellen15, was zeigte, dass es unempfindlich gegen Veränderungen der intrazellulären pH-Einheiten um etwa 0,1-0,2 pH-Einheiten ist. Wenn das Kd im niedrigen mM-Bereich ein Problem ist, könnten alternative ATeam-Varianten14verwendet werden, darunter rot verschobene Varianten von ATeam (“GO-ATeam”)43.
Unsere Experimente mit ATeam1.03YEMK zeigen, dass eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration nur um wenige mM (von 3 auf 8 mM) zu einer vorübergehenden Erhöhung des ATeam1.03YEMK-Verhältnisses in Astrozyten in der organotypischen Scheibenkultur führt. Diese Beobachtung bestätigt frühere Studien15,46 und zeigt deutlich, dass Astrozyten auf die Freisetzung von Kalium durch aktive Neuronen mit einer Erhöhung ihrer ATP-Produktion reagieren, meist wahrscheinlich als Folge einer Stimulation der Na+/K+-ATPase und der Na+/HCO3– Cotransporter, bzw.47,48. Im Gegensatz dazu zeigten Neuronen keine Antwort, die auch mit früheren Arbeiten im Einklang steht15. Beide Zelltypen reagierten jedoch schnell und stark auf die Hemmung der zellulären Glykolyse und der mitochondrialen Atmung, wie vor15gezeigt. Unter den Bedingungen der chemischen Ischämie fielen die ATeam FRET-Verhältnisse auf ein neues stabiles Niveau, was auf eine nominale Erschöpfung des zellulären ATP hindeutet. Das letztgenannte Ergebnis legt nahe, dass sowohl Neuronen als auch Astrozyten einen relevanten ATP-Verbrauch auch unter stationären Bedingungen ohne zusätzliche Stimulation durch synaptische Aktivierung oder Anwendung von Neurotransmittern aufweisen. Zusammengenommen kommen wir zu dem Schluss, dass FRET-basierte Bildgebung mit genetisch kodierten Nanosensoren, darunter ATeam1.03YEMK, einen wertvollen Ansatz bieten wird, um die zellulären Prozesse aufzuklären, die für Veränderungen der intrazellulären ATP-Spiegel und den zellulären ATP-Verbrauch unter verschiedenen Bedingungen verantwortlich sind.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei Claudia Roderigo und Simone Durry für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken Dr. Niklas J. Gerkau und M.Sc. Joel Nelson für die Unterstützung bei der Vorbereitung der organotypischen Scheibenkulturen. Die Forschung im Autorenlabor wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; FÜR 2795: Ro 2327/13-1 und SPP 1757: Ro 2327/8-2 zu CRR; und SPP 1757: Young Glia Start-Up-Förderung an RL).
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ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
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