Descrevemos um protocolo para a expressão específica do tipo celular do sensor geneticamente codificado baseado em FRET ATeam1.03YEMK em culturas organotípicas do antecérebro do rato. Além disso, mostramos como usar este sensor para imagens dinâmicas dos níveis de ATP celular em neurônios e astrócitos.
A atividade neuronal no sistema nervoso central (SNC) evoca uma alta demanda de energia celular fornecida pela quebra do triposfato de adenosina (ATP). Uma grande parte do ATP é necessária para reinstalar gradientes de íons através de membranas plasmáticas degradadas pela sinalização elétrica dos neurônios. Há evidências de que os astrócitos – embora não gerem sinais elétricos rápidos – passam pelo aumento da produção de ATP em resposta à atividade neuronal e suportam neurônios ativos, fornecendo metabólitos de energia para eles. O recente desenvolvimento de sensores geneticamente codificados para diferentes metabólitos agora permite o estudo de tais interações metabólicas entre neurônios e astrócitos. Aqui, descrevemos um protocolo para a expressão específica do tipo celular do sensor De setores de ressonância de ressonância (FRET-) aTeam1.03YEMK em culturas organotípicas de fatia de tecido do hipocampo e córtex do mouse usando vetores virais associados ao adeno (AAV). Além disso, demonstramos como este sensor pode ser empregado para a medição dinâmica das mudanças nos níveis de ATP celular em neurônios e astrócitos após aumentos no potássio extracelular e após a indução da isquemia química (ou seja, uma inibição do metabolismo energético celular).
A atividade elétrica excitatória dos neurônios é em grande parte baseada no fluxo de cições como sódio (Na+)e potássio (K+)através de suas membranas plasmáticas. A manutenção dos gradientes eletroquímicos destes dois íons é exigida assim para sinalizar. Isso é realizado pela celular Na+/K+-ATPase (NKA), uma bomba de transmembrana eletrogênica onipresentemente expressa, que extrude 3 Na+ fora da célula em troca de 2 K+ do espaço extracelular, exigindo o consumo de uma molécula de ATP por ciclo de transporte1. Além do NKA, existem vários outros transportadores de íons consumidores de ATP, incluindo a membrana plasmática Ca2+-ATPase, que é vital para a homeostase intracelular Ca2+ e sua exportação após o influxo induzido pela atividade2. Nas vesículas pré-sinápticas, um tipo vacuolar H+-ATPase (v-ATPase) cria o gradiente de prótons necessário para a captação de neurotransmissores neste compartimento3.
Enquanto a atividade dos neurônios, portanto, requer uma quantidade substancial de ATP4, eles não exibem uma capacidade significativa para o armazenamento de energia. Em vez disso, eles parecem confiar em interações metabólicas com os astrocitos vizinhos, as principais lojas de glicogênio no cérebro5. Tem sido sugerido que o glicogênio ascítico realmente desempenha um papel importante no apoio às necessidades de energia neuronal; e um fenômeno chave neste acoplamento neuro-metabólico proposto entre os dois tipos de células é a capacidade dos astrócitos para aumentar sua produção de ATP em resposta à atividade neuronal6,7,8. Esta hipótese, conhecida como ônibus de lactato do neurônio astrócito (ANLS), ainda está em debate, porque outros trabalhos forneceram evidências de que os neurônios também podem aumentar sua própria taxa de glicolíse em resposta à estimulação9,10,refletindo a necessidade de outros métodos e abordagens para estudar a interação neuro-glia.
Investigação do metabolismo da energia celular e níveis de ATP em neurônios e astrócitos para elucidar interações metabólicas neuro-glia tem sido dificultada pela falta de sondas adequadas para a detecção de mudanças nas concentrações de metabólitos em células vivas no tecido cerebral. A última década, no entanto, proporcionou um aumento no desenvolvimento de novas ferramentas e novas sondas fluorescentes geneticamente codificadas para diferentes metabólitos, incluindo sensores para ATP, lactato, piruvato e outros11,12. Usando essas ferramentas, agora é possível abordar diretamente questões relacionadas ao consumo de ATP celular e mudanças nos níveis de energia celular no nível de célula única e de forma específica do tipo celular no tecido cerebral intacto13.
No presente trabalho, descrevemos um procedimento para visualizar a dinâmica citossólica atp em neurônios e astrócitos de fatias de cérebro organotypic culturado. Mostramos como empregar vetores virais associados ao adeno (AAV) para expressão específica do tipo célula do atp-nanosensor geneticamente codificado ATeam1.03YEMK (14) em neurônios e astrócitos de fatias de cérebro de rato que podem ser mantidas na cultura celular por várias semanas15. Um procedimento de como remover a cicatriz glial que cobre fatias cultivadas do tecido é descrito, que melhora a acessibilidade ótica e a imagem latente das pilhas nas camadas organotypic do tecido embaixo. Finalmente, mostramos como o ATeam1.03YEMK pode ser usado para realizar imagens baseadas em FRET de alterações nos níveis de ATP celular nesta preparação. Este método hospeda as principais vantagens de que não requer procedimentos cerebrais cirúrgicos, fornece altos níveis de expressão do sensor e especificidade do tipo celular em fatias cerebrais cultivadas, reduzindo a invasividade ou estresse nas células em comparação com outros métodos, como a transfecção por eletroporação ou transdução com outros vetores virais10,16,17. Além disso, este protocolo pode ser aplicado a outros nanosensores baseados em FRET, entre eles variantes do ATeam1.03 que fornecem menor afinidade de ligação para ATP14.
Aqui, demonstramos um procedimento para a expressão específica do tipo célula de ATeam1.03YEMK, um nanosensor14geneticamente codificado por FRET, para medição de alterações nos níveis de ATP em astrocitos ou neurônios em culturas organotípicas de fatia de tecido do cérebro do rato15. Em gravações exemplares, mostramos que um aumento na concentração de potássio extracelular não resulta em uma mudança nas concentrações de ATP nos neurônios, enquanto os níveis ascíticos de ATP aumentam em resposta a essa manipulação. Além disso, nossos resultados demonstram que, após a inibição do metabolismo celular, a relação ATeam1.03YEMK FRET cai rapidamente em ambos os tipos de células, indicando uma rápida diminuição do ATP intracelular.
Expressão de ATeam1.03YEMK em culturas organotípicas da fatia exige a manutenção do tecido na cultura circunstâncias controladas no mínimo 7-10 dias. Alternativamente, ATeam1.03YEMK também pode ser empregado para a medição de ATP em fatias de tecido cerebral agudamente isoladas e em nervos ópticos de camundongos13,15. Medidas em tecido suprido agudamente, no entanto, exigem a geração de animais transgênicos ou uma aplicação estereotática de vetores virais no cérebro, envolvendo experimentação animal e protocolos rigorosos de cuidados com animais. A este respeito, a expressão deYEMK ATeam1.03 em culturas organotípicas da fatia do tecido representa uma alternativa útil e valiosa22,23. Há muitos anos, culturas organotípicas de fatias de tecido servem como um sistema modelo estabelecido para estudar propriedades neurais, conectividade e desenvolvimento24,25,26. Eles não só mantêm a arquitetura geral do tecido e laminação (Figura 1), mas também hospedam as propriedades preferenciais das culturas celulares, como acessibilidade superior e controle direto das condições experimentais. As culturas organotípicas da fatia do tecido são empregadas igualmente rotineiramente para expressar genes extrangeiros usando vetores virais27. Vários tipos de vetores virais foram relatados para entregar transgenes no tecido cerebral16,28. Vetores adenovirais induzir alta expressão em células gliais, mas não neurônios hipocampais16, e pode gerar reatividade glial17. Vetores virais associados ao Adeno, como usados aqui, emergem como uma boa alternativa15,e sua eficácia também foi mostrada in vivo29.
Embora seja usado principalmente para o estudo de propriedades neuronais, estudos recentes estabeleceram que culturas organotípicas de fatia sitipade também podem ser empregadas para a análise de astrócitos. As fatias cultivadas são geralmente cobertas por uma camada de astrócitos reativos19,30 (Figura 5), mas os astrócitos exibem uma morfologia e citoarquitetura mais nativas e não reativas em camadas mais profundas19,30 (Figura 5). No presente estudo, descrevemos um procedimento para a remoção mecânica da cicatriz glial externa, o que resulta em uma melhor acessibilidade experimental e óptica de astrócitos nativos dentro das camadas adequadas do tecido organotypic. Além disso, sua remoção melhora a eficácia da expressão em camadas mais profundas das fatias organotípicas; se a cicatriz glial não for removida, a transdução por AAVs pode tender a ser restrita às camadas celulares superficiais.
Vários fatores mecânicos externos precisam ser considerados ao realizar experimentos em fatias de tecido. Uma variação na velocidade da perfusão do banho pode induzir movimentos da preparação inteira e/ou induzir mudanças no foco, tendo por resultado mudanças transientes artificiais do sinal do sensor. Além disso, tanto os astrócitos quanto os neurônios têm sido relatados para responder à deformação mecânica, como imposta s altas taxas de perfusão32,33. Em nossas mãos, usando uma bomba peristaltic de confiança, junto com a manutenção de volumes pequenos e estáveis de salina entre o tecido e o objetivo (menisco) conduz a um FRET-sinal estável circunstâncias da linha de base na velocidade da perfusão usada aqui (1.5-2.5 mL/min; Figura 8).
No presente estudo, também demonstramos que imagens baseadas em FRET com ATeam1.03YEMK podem ser empregadas para monitorar os níveis de ATP em neurônios e astrócitos. Um meio alternativo introduzido anteriormente para a medição do ATP celular é o chamado ensaio luciferin-lúciferase34,35,36,37. Esta abordagem, no entanto, é baseada em imagens de bioluminescência e fornece apenas uma resolução temporal e espacial bastante baixa, em parte devido aos altos níveis de ruído de fundo. Outro método rotineiramente empregado nos últimos anos foi a imagem de mudanças na concentração intracelular de magnésio usando o verde38,39,40. Essa abordagem diz respeito à observação de que o consumo de ATP resulta na liberação de seu cofator magnésio. A imagem latente com verde do magnésio fornece desse modo somente uma estimativa secundária das mudanças em níveis do ATP. Além disso, o verde magnésio também é sensível às mudanças no cálcio intracelular, introduzindo outra dificuldade na interpretação dos resultados obtidos com este método.
O recente desenvolvimento de nanosensores geneticamente codificados para imagens diretas de metabólitos celulares, portanto, representou um grande passo em frente11,12. Vários sensores diferentes foram gerados que podem ser empregados para medição do ATP intracelular36,41,42,43. Entre eles estão o indicador de ATP fluorescente ratiométrica “QUEEN”41, bem como PercevalHR, que detecta a relação ATP:ADP42. Enquanto a última sonda é uma ferramenta valiosa para o estudo do estado energético das células, requer medição simultânea de alterações no pH42.
ATeam é um nanosensor do qual existem várias variantes, que – entre outras – diferem em sua afinidade vinculativa para atp14. In vitro, ATeam1.03YEMK exibe um Kd de 1.2 mM em 37 °C, que está perto dos níveis de ATP celulares determinados em diferentes tipos de células neuronais, variando de hipotálamo e cerebelo34 a hipocampo37,44,45. Nas medições de cuvette, a redução da temperatura em 10 °C resultou em uma diminuição significativa na afinidade vinculativa de ATeam1.03YEMK para ATP, sugerindo que pode não ser ideal para imagens celulares à temperatura ambiente14. Nosso estudo anterior15, no entanto, demonstrou que o comportamento e a resposta do ATeam1.03YEMK expressos em neurônios e astrócitos a diferentes manipulações é semelhante a quase fisiológico e à temperatura ambiente, indicando que o sensor permite determinação confiável dos níveis intracelulares de ATP em ambas as condições. Além disso, nossos experimentos anteriores abordaram a sensibilidade ao pH do ATeam1.03YEMK expressa dentro das células15,mostrando que é insensível às mudanças no pH intracelular em cerca de 0,1-0,2 unidades pH. Se o Kd na faixa de mM baixo é uma preocupação, variantes alternativas ATeam pode ser usado14,entre eles variantes em mudança vermelha de ATeam (“GO-ATeam”)43.
Nossos experimentos usando OYEMK ATeam1.03 demonstram que um aumento na concentração de potássio extracelular em alguns mM apenas (de 3 para 8 mM) resulta em um aumento transitório na relaçãoYEMK ATeam1.03 em astrocitos na cultura de fatia organótípica. Esta observação confirma estudos anteriores15,46 e indica claramente que os astrócitos respondem à liberação de potássio por neurônios ativos com um aumento na sua produção atp, principalmente provável como conseqüência de uma estimulação do Na+/ K+-ATPase e o Na+/ HCO3– cotransportador, respectivamente47,48. Em contraste com isso, os neurônios não mostraram uma resposta, que está em linha com o trabalho anterior também15. Ambos os tipos de células, no entanto, reagiram rapidamente e fortemente à inibição da glicolyse celular e respiração mitocondrial, como mostrado antesde 15. Em condições de isquemia química, as proporções de FRET da ATeam caíram para um novo nível estável, indicando um esgotamento nominal do ATP celular. O último resultado sugere que ambos os neurônios, bem como astrócitos apresentam um consumo relevante de ATP também condições de estado estável, sem estimulação adicional por ativação sináptica ou aplicação de neurotransmissores. Em conjunto, concluímos que a imagem de imagens baseadas em FRET com nanosensores geneticamente codificados, entre eles ATeam1.03YEMK,fornecerá uma abordagem valiosa para elucidar os processos celulares responsáveis por mudanças nos níveis intracelulares de ATP e no consumo de ATP celular em diferentes condições.
The authors have nothing to disclose.
Os autores desejam agradecer a Claudia Roderigo e Simone Durry por assistência técnica especializada. Agradecemos ao Dr. Niklas J. Gerkau e ao M.Sc. Joel Nelson pela ajuda na preparação das culturas organotípicas. A pesquisa no laboratório do autor foi financiada pela Associação Alemã de Pesquisa (DFG; PARA 2795: Ro 2327/13-1 e SPP 1757: Ro 2327/8-2 a CRR; e SPP 1757: Financiamento start-up da Glia Young para rl).
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