Generación de mutantes de eliminación de genes en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas para la atenuación de la virulencia en un modelo simple de infección de ratón
Summary
Aquí, describimos un protocolo simple y reproducible del modelo de ratón de infección para evaluar la atenuación de las cepas modificadas genéticamente de Pseudomonas aeruginosa en comparación con la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) aprobada por escherichia coli para aplicaciones comerciales.
Abstract
Los microorganismos son genéticamente versátiles y diversos y se han convertido en una fuente importante de muchos productos comerciales y biofarmacéuticos. Aunque algunos de estos productos son producidos naturalmente por los organismos, otros productos requieren ingeniería genética del organismo para aumentar los rendimientos de la producción. Las cepas avirulentes de Escherichia coli han sido tradicionalmente la especie bacteriana preferida para la producción de productos biofarmacéuticos; sin embargo, algunos productos son difíciles de producir para E. coli. Por lo tanto, las cepas avirulentes de otras especies bacterianas podrían proporcionar alternativas útiles para la producción de algunos productos comerciales. Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa común y bien estudiada que podría proporcionar una alternativa adecuada a E. coli. Sin embargo, P. aeruginosa es un patógeno humano oportunista. Aquí, detallamos un procedimiento que se puede utilizar para generar cepas no patógenas de P. aeruginosa a través de deleciones genómicas secuenciales utilizando el plásmido pEX100T-NotI. La principal ventaja de este método es producir una cepa sin marcadores. Este método se puede utilizar para generar cepas P. aeruginosa altamente atenuadas para la producción de productos comerciales, o para diseñar cepas para otros usos específicos. También describimos un modelo de ratón simple y reproducible de infección sistémica bacteriana a través de la inyección intraperitoneal de cepas de prueba validadas para probar la atenuación de la cepa genéticamente diseñada en comparación con la cepa BL21 aprobada por la FDA de E. coli.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno bacteriano oportunista que puede causar enfermedades potencialmente mortales en humanos, especialmente en los inmunocomprometidos. La patogenicidad de P. aeruginosa se debe a la expresión de muchos factores de virulencia, incluyendo proteasas y lipopolisacáridos, así como su capacidad para formar una biopelícula protectora1. Debido a su capacidad para producir factores de virulencia y causar enfermedades en los seres humanos, el uso de P. aeruginosa para hacer productos comerciales presenta problemas de seguridad. Cepas no patógenas de E. coli se han utilizado tradicionalmente para bioingeniero productos médicos y comerciales para uso humano. Sin embargo, algunos productos son difíciles de hacer para E. coli, y muchos se empaquetan en cuerpos de inclusión, lo que hace que la extracción sea laboriosa. Las cepas bacterianas diseñadas con la capacidad de fabricar y secretar productos específicos son altamente deseables, ya que la secreción probablemente aumentaría el rendimiento y facilitaría los procesos de purificación. Por lo tanto, cepas no patógenas de otras especies de bacterias (por ejemplo, especies que utilizan más vías de secreción) pueden proporcionar alternativas útiles a E. coli. Recientemente informamos del desarrollo de una cepa de P. aeruginosa,PGN5, en la que la patogenicidad y toxicidad del organismo está altamente atenuada2. Es importante destacar que esta cepa todavía produce grandes cantidades de alginato polisacárido, un componente comercialmente interesante de la biopelícula de P. aeruginosa.
La cepa PGN5 se generó utilizando un procedimiento de intercambio alélico de dos pasos con el plásmido pEX100T-NotI para eliminar secuencialmente cinco genes (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) conocido por contribuir a la patogenicidad del organismo. pEX100T-NotI se generó cambiando el SmaI a un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción NotI dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido pEX100T, que fue desarrollado en el laboratorio de Herbert Schweizer3,4. El sitio de reconocimiento de la enzima de restricción NotI es una secuencia de ADN más rara en comparación con SmaI y menos probable que esté presente en secuencias que se clonan, por lo que es más conveniente para fines de clonación. El plásmido lleva genes que permiten la selección, incluido el gen bla, que codifica la lactamasa y confiere resistencia a la carenicilina, y el gen B. subtilissacB, que confiere sensibilidad a la sacarosa (Figura 1A). El plásmido también tiene un origen de replicación (ori) compatible con E. coli,y un origen de transferencia (oriT) que permite la transferencia de plásmido de E. coli a las especies de Pseudomonas a través de la conjugación. Sin embargo, el plásmido carece de un origen de replicación compatible con Pseudomonas,y por lo tanto no puede replicarse dentro de las especies de Pseudomonas (es decir, es un vector suicida pseudomonas). Estas características hacen que pEX100T-NotI sea ideal para atacar deleciones genéticas del cromosoma Pseudomonas. Los pasos de clonación plásmidos se llevan a cabo utilizando E. coli y el plásmido resultante se transfiere a Pseudomonas por transformación o conjugación. A continuación, a través de eventos de recombinación homóloga y pasos selectivos, se genera la eliminación en trama objetivo, sin marcadores. Este método de eliminación secuencial de regiones genómicas del cromosoma de P. aeruginosa podría utilizarse para generar cepas de Pseudomonas altamente atenuadas, como PGN5, o para diseñar cepas para otros usos específicos (por ejemplo, cepas deficientes en endonucleases para la propagación de plásmidos o cepas deficientes en proteasas para la producción de proteínas de interés).
La virulencia general de las cepas de bacterias se ve afectada por las condiciones de crecimiento y las fases, durante las cuales las mutaciones ocurren con frecuencia. Por lo tanto, medir la seguridad de las cepas genéticamente diseñadas puede ser un desafío. Para evaluar los aislados bacterianos para la virulencia sistémica, adaptamos un protocolo de infección previamente publicado por inyección intraperitoneal de ratones C57BL/65. Modificamos este procedimiento para utilizar existencias bacterianas congeladas para inyección, lo que permitió una dosificación precisa y una fácil validación de las cepas utilizadas. En este modelo, la cepa E. coli BL21, que ha sido aprobada por la FDA para la producción de biofarmacéuticos, se utilizó como un estándar de seguridad de control para determinar la patogénesis relativa de la cepa6,7,8. La principal ventaja de utilizar este método es que es reproducible y minimiza las fuentes de variación, ya que las cepas infectantes se validan para el número de células bacterianas, fenotipo, y marcadores genéticos antes y después de la infección. Con estos pasos controlados, se reduce el número de animales requeridos. En este modelo, las cepas de P. aeruginosa que dan como resultado tasas de mortalidad murina C57BL/6 iguales o inferiores a E. coli BL21 cuando se inyectan por vía intraperitoneal pueden considerarse atenuadas. Este modelo simple de infección de ratón también se puede utilizar para evaluar la patogenicidad atenuada de cepas genéticamente diseñadas de otras especies utilizando la cepa E. coli aprobada por la FDA como referencia. Los pasos 1-7 detallan la generación de deleciones genómicas secuenciales en P. aeruginosa (Figura 1) y los pasos 8-12 detallan el uso de un modelo de ratón para probar la patogenicidad de las cepas de P. aeruginosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
El plásmido pEX100T-Not1 es un mediador eficiente de eliminaciones genómicas secuenciales que están libres de marcadores y en fotograma. Cuando se diseñan cepas bacterianas para la virulencia atenuada, la eliminación de secuencias genéticas enteras en lugar de generar mutaciones puntuales disminuye la probabilidad de reversión a un fenotipo virulento. Además, cada deleción del gen de la patogenicidad atenúa aún más al patógeno, reforzando la estabilidad de la atenuación.
Este mé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R44GM113545 y P20GM103434.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
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