Generazione di mutanti di eliminazione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello di infezione del mouse
Summary
Qui, descriviamo un protocollo semplice e riproducibile del modello murino di infezione per valutare l’attenuazione dei ceppi geneticamente modificati di Pseudomonas aeruginosa rispetto alla Escherichia coli approvata dalla FDA (Food and Drug Administration) degli Stati Uniti per applicazioni commerciali.
Abstract
I microrganismi sono geneticamente versatili e diversificati e sono diventati una fonte importante di molti prodotti commerciali e biofarmaceutici. Anche se alcuni di questi prodotti sono prodotti naturalmente dagli organismi, altri prodotti richiedono l’ingegneria genetica dell’organismo per aumentare le rese di produzione. I ceppi avirulenti di Escherichia coli sono stati tradizionalmente le specie batteriche preferite per la produzione di prodotti biofarmaceutici; tuttavia, alcuni prodotti sono difficili da produrre per E. coli. Pertanto, ceppi avirulenti di altre specie batteriche potrebbero fornire alternative utili per la produzione di alcuni prodotti commerciali. Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram-negativo comune e ben studiato che potrebbe fornire un’alternativa adatta a E. coli. Tuttavia, P. aeruginosa è un patogeno umano opportunistico. Qui, dettagliamo una procedura che può essere utilizzata per generare ceppi non patogeni di P. aeruginosa attraverso eliminazioni genomiche sequenziali utilizzando il plasmide pEX100T-NotI. Il vantaggio principale di questo metodo è quello di produrre una deformazione senza marcatori. Questo metodo può essere utilizzato per generare ceppi P. aeruginosa altamente attenuati per la produzione di prodotti commerciali, o per progettare ceppi per altri usi specifici. Descriviamo anche un modello murino semplice e riproducibile di infezione sistemica batterica tramite iniezione intraperitoneale di ceppi di prova convalidati per testare l’attenuazione del ceppo geneticamente ingegnerizzato rispetto al ceppo BL21 approvato dalla FDA di E. coli.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa è un patogeno batterico opportunistico che può causare malattie potenzialmente letali nell’uomo, specialmente nell’immunocompromesso. La patogenicità di P. aeruginosa è dovuta all’espressione di molti fattori di virulenza, tra cui proteasi e lipopolisaccharide, così come la sua capacità di formare un biofilm protettivo1. A causa della sua capacità di produrre fattori di virulenza e causare malattie negli esseri umani, utilizzando P. aeruginosa per fare prodotti commerciali presenta problemi di sicurezza. I ceppi non patogeni di E. coli sono stati tradizionalmente utilizzati per bioingegnerizzare prodotti medici e commerciali per uso umano. Tuttavia, alcuni prodotti sono difficili da fare per E. coli, e molti sono confezionati in corpi di inclusione, rendendo l’estrazione laboriosa. Ceppi batterici ingegnerizzati con la capacità di fare e secernere prodotti specifici è altamente auspicabile, in quanto la secrezione probabilmente aumenterebbe i processi di purificazione della resa e della facilità. Pertanto, i ceppi non patogeni di altre specie di batteri (ad esempio, specie che utilizzano più percorsi di secrezione) possono fornire alternative utili a E. coli. Recentemente abbiamo riportato lo sviluppo di un ceppo di P. aeruginosa, PGN5, in cui la patogenicità e la tossicità dell’organismo è altamente attenuata2. È importante sottolineare che questo ceppo produce ancora grandi quantità di polisaccharide alginata, una componente commercialmente interessante del biofilm P. aeruginosa.
Il ceppo PGN5 è stato generato utilizzando una procedura di scambio allelico in due fasi con il plasmid pEX100T-NotI per eliminare in sequenza cinque geni (toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) noti per contribuire alla patogenicità dell’organismo. pEX100T-NotI è stato generato cambiando il SmaI in un sito di riconoscimento degli enzimi di restrizione NotI all’interno del sito di clonazione multipla del pEX100T pEX100T, sviluppato nellaboratorio3,4di Herbert Schweizer. Il sito di riconoscimento per l’enzima di restrizione NotI è una sequenza di DNA più rara rispetto a SmaI e meno probabilità di essere presente nelle sequenze clonate, quindi è più conveniente per scopi di clonazione. Il plasmide porta geni che consentono la selezione, compreso il gene bla, che codifica la lattamasi e conferisce resistenza alla carbenicillina, e il gene B. subtilissacB, che conferisce sensibilità al saccarosio (Figura 1A). Il plasmide porta anche un’origine di replica (ori) compatibile con E. coli, e un’origine di trasferimento (oriT) che permette il trasferimento di plasmide da E. coli alle specie di Pseudomonas attraverso la coniugazione. Tuttavia, il plasmide manca di un’origine di replica compatibile con Pseudomonas, e quindi non può replicare all’interno di specie Pseudomonas (cioè, è un vettore suicida Pseudomonas). Queste caratteristiche rendono pEX100T-NotI ideale per colpire le delezioni genetiche dal cromosoma Pseudomonas. Le fasi di clonazione plasmide vengono eseguite utilizzando E. coli e il plasmide risultante viene trasferito a Pseudomonas per trasformazione o coniugazione. Quindi, attraverso eventi di ricombinazione omologhi e passaggi selettivi, viene generata l’eliminazione in-frame mirata, senza marcatori. Questo metodo di eliminazione sequenziale delle regioni genomiche dal cromosoma di P. aeruginosa potrebbe essere utilizzato per generare ceppi Pseudomonas altamente attenuati, come PGN5, o per progettare ceppi per altri usi specifici (ad esempio, ceppi carenti in endonuclesi per la propagazione plasmida o ceppi carenti nelle proteasi per la produzione di proteine di interesse).
La virulenza complessiva dei ceppi di batteri è influenzata dalle condizioni di crescita e dalle fasi, durante le quali le mutazioni si verificano frequentemente. Pertanto, misurare la sicurezza dei ceppi geneticamente progettati può essere difficile. Per valutare gli isolati batterici per la virulenza sistemica, abbiamo adattato un protocollo di infezione pubblicato in precedenza mediante iniezione intraperitoneale di topi C57BL/65. Abbiamo modificato questa procedura per utilizzare gli stock batterici congelati per l’iniezione, che ha permesso un dosing preciso e una facile convalida dei ceppi utilizzati. In questo modello, il ceppo E. coli BL21, approvato dalla FDA per la produzione di prodotti biofarmaceutici, è stato utilizzato come standard di sicurezza di controllo per determinare la patogenesi relativa del ceppo6,7,8. Il vantaggio principale dell’utilizzo di questo metodo è che è riproducibile e riduce al minimo le fonti di variazione, in quanto i ceppi infettanti sono convalidati per il numero di cellule batteriche, il fenotipo e i marcatori genetici sia prima che dopo l’infezione. Con questi passaggi controllati, il numero di animali necessari è ridotto. In questo modello, i ceppi di P. aeruginosa che provocano C57BL/6 tassi di mortalità murina uguali o inferiori a E. coli BL21 quando iniettati intraperitonealmente possono essere considerati attenuati. Questo semplice modello murino di infezione può anche essere utilizzato per valutare la patogenicità attenuata dei ceppi geneticamente ingegnerizzati di altre specie utilizzando il ceppo E. coli approvato dalla FDA come riferimento. I passaggi da 1 a 7 descrivono in dettaglio la generazione di eliminazioni genomiche sequenziali in P. aeruginosa (Figura 1) e i passaggi 8-12 dettagliano l’uso di un modello murino per testare la patogenicità dei ceppi P. aeruginosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il plasmide pEX100T-Not1 è un efficiente mediatore di eliminazioni genomiche sequenziali prive di marcatori e in-frame. Quando si ingegnerizzano ceppi batterici per la virulenza attenuata, la delezione di intere sequenze geniche piuttosto che la generazione di mutazioni puntiformi riduce la probabilità di ritorno a un fenotipo virulento. Inoltre, ogni delezione genica patogenicity attenua ulteriormente l’agente patogeno, rafforzando la stabilità dell’attenuazione.
Questo metodo può essere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R44GM113545 e P20GM103434.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
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