Generierung von In-Frame-Gen-Deletion Mutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf VirulenzDämpfung in einem einfachen Mausmodell der Infektion
Summary
Hier beschreiben wir ein einfaches und reproduzierbares Protokoll des Mausmodells der Infektion, um die Dämpfung der genetisch veränderten Stämme von Pseudomonas aeruginosa im Vergleich zur von der United States Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Escherichia coli für kommerzielle Anwendungen zu bewerten.
Abstract
Mikroorganismen sind genetisch vielseitig und vielfältig und haben sich zu einer wichtigen Quelle für viele kommerzielle Produkte und Biopharmazeutika entwickelt. Obwohl einige dieser Produkte natürlich von den Organismen produziert werden, erfordern andere Produkte Gentechnik des Organismus, um die Produktionserträge zu erhöhen. Avirulen-Stämme von Escherichia coli sind traditionell die bevorzugte Bakterienart für die Herstellung von Biopharmazeutika; einige Produkte sind jedoch für E. coli schwer herzustellen. So könnten avirulente Stämme anderer Bakterienarten nützliche Alternativen für die Produktion einiger kommerzieller Produkte bieten. Pseudomonas aeruginosa ist ein häufiges und gut untersuchtes Gram-negatives Bakterium, das eine geeignete Alternative zu E. colibieten könnte. P. aeruginosa ist jedoch ein opportunistischer menschlicher Erreger. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das verwendet werden kann, um nicht pathogene Stämme von P. aeruginosa durch sequenzielle genomische Deletionen mit dem pEX100T-NotI-Plasmid zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, einen markerfreien Stamm zu erzeugen. Diese Methode kann verwendet werden, um stark abgeschwächte P. aeruginosa-Stämme für die Herstellung kommerzieller Produkte zu erzeugen oder Stämme für andere spezifische Verwendungszwecke zu entwerfen. Wir beschreiben auch ein einfaches und reproduzierbares Mausmodell der bakteriellen systemischen Infektion durch intraperitoneale Injektion von validierten Teststämmen, um die Dämpfung des gentechnisch veränderten Stammes im Vergleich zum FDA-zugelassenen BL21-Stamm von E. colizu testen.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer bakterieller Erreger, der beim Menschen lebensbedrohliche Krankheiten verursachen kann, insbesondere bei immungeschwächten. Die Pathogenität von P. aeruginosa ist auf die Expression vieler Virulenzfaktoren, einschließlich Proteasen und Lipopolysaccharid, sowie seine Fähigkeit, einen schützenden Biofilm zubilden, zurückzuführen. Aufgrund seiner Fähigkeit, Virulenzfaktoren zu produzieren und Krankheiten beim Menschen verursachen, stellt die Verwendung von P. aeruginosa zur Herstellung kommerzieller Produkte Sicherheitsbedenken dar. Nichtpathogene Stämme von E. coli werden traditionell verwendet, um medizinische und kommerzielle Produkte für den menschlichen Gebrauch zu bioengineering. Jedoch, einige Produkte sind schwierig für E. coli zu machen, und viele sind in Inklusionsgremien verpackt, so dass Extraktion mühsam. Technische Bakterienstämme mit der Fähigkeit, bestimmte Produkte herzustellen und zu sezernieren, sind sehr wünschenswert, da die Sekretion wahrscheinlich die Ausbeute erhöhen und Reinigungsprozesse erleichtern würde. So können nicht pathogene Stämme anderer Bakterienarten (z. B. Arten, die mehr Sekretionswege nutzen) nützliche Alternativen zu E. coli bieten. Wir berichteten vor kurzem die Entwicklung eines Stammes von P. aeruginosa, PGN5, in dem die Pathogenität und Toxizität des Organismus stark abgeschwächt ist2. Wichtig ist, dass dieser Stamm immer noch große Mengen des Polysaccharidalginats produziert, einem kommerziell interessanten Bestandteil des Biofilms P. aeruginosa.
Der PGN5-Stamm wurde mit einem zweistufigen Allelic-Austauschverfahren mit dem pEX100T-NotI-Plasmid erzeugt, um fünf Gene(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA) sequenziell zu löschen, die bekanntermaßen zur Pathogenität des Organismus beitragen. pEX100T-NotI wurde durch die Umwandlung des SmaI in eine NotI-Restriktionsenzymerkennungsstelle innerhalb der Mehrfachklonstelle des Plasmids pEX100T erzeugt, die im Labor von Herbert Schweizer entwickelt wurde3,4. Die Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym NotI ist eine seltenere DNA-Sequenz im Vergleich zu SmaI und ist weniger wahrscheinlich in geklonten Sequenzen vorhanden, daher ist es für Klonzwecke bequemer. Das Plasmid trägt Gene, die eine Selektion ermöglichen, einschließlich des bla-Gens, das ß-Lactamase kodiert und Resistenzen gegen Carbenicillin verleiht, und das B. subtilissacB-Gen, das die Empfindlichkeit gegenüber Saccharose verleiht (Abbildung 1A). Das Plasmid trägt auch einen Ursprung der Replikation (ori) kompatibel mit E. coli, und einen Ursprung der Übertragung (oriT), die plasmid Transfer von E. coli zu Pseudomonas Arten über Konjugation ermöglicht. Dem Plasmid fehlt jedoch ein mit Pseudomonaskompatibler Replikationsursprung und kann daher innerhalb der Pseudomonas-Arten nicht replizieren (d. h. es handelt sich um einen Pseudomonas-Selbstmordvektor). Diese Eigenschaften machen pEX100T-NotI ideal für die gezielte genetische Deletion aus dem Pseudomonas-Chromosom. Plasmid-Klonschritte werden mit E. coli durchgeführt und das resultierende Plasmid wird durch Umwandlung oder Konjugation auf Pseudomonas übertragen. Dann wird durch homologe Rekombinationsereignisse und selektive Schritte die gezielte In-Frame-Deletion generiert, markerfrei. Diese Methode, genomische Regionen sequenziell aus dem Chromosom von P. aeruginosa zu löschen, könnte verwendet werden, um stark abgeschwächte Pseudomonas-Stämme wie PGN5 zu erzeugen oder Stämme für andere spezifische Anwendungen zu entwerfen (z. B. Stämme, die einen Mangel an Endonukleasen für die Plasmidvermehrung haben, oder Stämme, die einen Mangel an Proteasen für die Produktion von Proteinen von Interesse haben).
Die allgemeine Virulenz von Bakterienstämmen wird durch Wachstumsbedingungen und Phasen beeinflusst, in denen Mutationen häufig auftreten. Daher kann die Messung der Sicherheit gentechnisch veränderter Stämme eine Herausforderung darstellen. Um bakterielle Isolate auf systemische Virulenz zu untersuchen, haben wir ein zuvor veröffentlichtes Infektionsprotokoll durch intraperitoneale Injektion von C57BL/6-Mäusen5angepasst. Wir haben dieses Verfahren modifiziert, um gefrorene Bakterienvorräte für die Injektion zu verwenden, was eine präzise Beweichung und eine einfache Validierung der verwendeten Stämme ermöglichte. In diesem Modell wurde der E. coli-Stamm BL21, der von der FDA für die Herstellung von Biopharmazeutika zugelassen ist, als Kontrollsicherheitsstandard für die Bestimmung der relativen Pathogenese des Stammes6,7,8verwendet. Der Hauptvorteil der Verwendung dieser Methode ist, dass es reproduzierbar ist und Variationsquellen minimiert, da infizierende Stämme für bakterielle Zellzahl, Phänotyp und genetische Marker sowohl vor als auch nach der Infektion validiert werden. Mit diesen kontrollierten Schritten wird die Anzahl der benötigten Tiere reduziert. In diesem Modell können P. aeruginosa-Stämme, die zu C57BL/6 murinen Sterblichkeitsraten von e. coli BL21 führen, wenn sie intraperitoneal injiziert werden, als abgeschwächt angesehen werden. Dieses einfache Mausmodell der Infektion kann auch verwendet werden, um die abgeschwächte Pathogenität von gentechnisch veränderten Stämmen anderer Arten unter Verwendung des von der FDA zugelassenen E. coli-Stamms als Referenz zu bewerten. In den Schritten 1-7 wird die Generierung sequenzieller genomischer Deletionen in P. aeruginosa (Abbildung 1) und die Schritte 8-12 detailliert die Verwendung eines Mausmodells zur Erprobung der Pathogenität von P. aeruginosa-Stämmen beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das pEX100T-Not1 Plasmid ist ein effizienter Vermittler sequenzieller genomischer Deletionen, die markerfrei und im Rahmen sind. Bei der Entwicklung von Bakterienstämmen für abgeschwächte Virulenz verringert das Löschen ganzer Gensequenzen anstatt Punktmutationen zu generieren, die Wahrscheinlichkeit einer Rückkehr zu einem virulenten Phänotyp. Zusätzlich dämtt jede Pathogenitätsgen-Deletion den Erreger weiter ab und verstärkt die Stabilität der Dämpfung.
Diese Methode kann auch ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den Nationalen Instituten für Gesundheit (NIH) Stipendien R44GM1113545 und P20GM103434 unterstützt.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
References
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