अलगाव और माउस कंकाल मांसपेशी एक्सप्लांट्स से प्राथमिक मायोब्लास्ट्स के भेदभाव
Summary
मायोब्लास्ट्स पूर्ववर्ती कोशिकाओं को बढ़ारहे हैं जो पॉलीन्यूक्लिएट मायोट्यूब और अंततः कंकालीय मांसपेशी मायोफाइबर बनाने में अंतर करते हैं। यहाँ, हम कुशल अलगाव और युवा वयस्क माउस कंकाल की मांसपेशियों से प्राथमिक मायोब्लास्ट ्स्स्मेशन के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। विधि आणविक सक्षम बनाता है, आनुवंशिक, और संस्कृति में मांसपेशियों की कोशिकाओं के चयापचय अध्ययन.
Abstract
प्राथमिक मायोब्लास्ट कंकाल की मांसपेशी के अपृथक्करणीय प्रसारी अग्रदूत होते हैं. वे सुसंस्कृत किया जा सकता है और मांसपेशियों के अग्रदूतों के रूप में अध्ययन किया या मांसपेशियों के विकास के बाद के चरणों में अंतर करने के लिए प्रेरित किया. यहाँ प्रदान की प्रोटोकॉल अलगाव और युवा वयस्क माउस कंकाल मांसपेशी explants से मायोब्लास्ट कोशिकाओं की एक अत्यधिक proliferative आबादी की संस्कृति के लिए एक मजबूत विधि का वर्णन करता है. इन कोशिकाओं को अलग माउस मॉडल के कंकाल की मांसपेशी के चयापचय गुणों के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं, साथ ही exogenous डीएनए या वायरल अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ transduction के साथ transfection के रूप में अन्य बहाव अनुप्रयोगों में. इन कोशिकाओं के भेदभाव और चयापचय प्रोफ़ाइल का स्तर जोखिम की लंबाई पर निर्भर करता है, और मायोब्लास्ट भेदभाव पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया मीडिया की संरचना। इन तरीकों माउस मांसपेशी सेल चयापचय पूर्व vivo के अध्ययन के लिए एक मजबूत प्रणाली प्रदान करते हैं. महत्वपूर्ण बात, vivo मॉडल के विपरीत, यहाँ वर्णित तरीकों एक सेल आबादी है कि विस्तार किया जा सकता है और reproducibility के उच्च स्तर के साथ अध्ययन प्रदान करते हैं.
Introduction
जबकि अक्सर समग्र चयापचय स्वास्थ्य का एक संकेत के रूप में उद्धृत, कई अध्ययनों से पता चला है कि शरीर द्रव्यमान सूचकांक (बीएमआई) पुराने वयस्कों में लगातार मृत्यु के उच्च जोखिम के साथ जुड़ा हुआ नहीं है. आज तक, इस जनसंख्या में कम मृत्यु दर के अनुरूप होने के लिए दिखाया गया एकमात्र कारक मांसपेशियों में वृद्धि हुई है1. मांसपेशियों के ऊतकों शरीर में इंसुलिन के प्रति संवेदनशील कोशिकाओं का सबसे बड़ा स्रोतों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है, और इसलिए समग्र चयापचय homeostasis2के रखरखाव में महत्वपूर्ण है. व्यायाम के माध्यम से कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों के सक्रियण दोनों स्थानीय इंसुलिन संवेदनशीलता और समग्र चयापचय स्वास्थ्य3में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है . जबकि vivo मॉडल में मांसपेशियों शरीर क्रिया विज्ञान और एकीकृत चयापचय पर मांसपेशी समारोह के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं, मायोट्यूब की प्राथमिक संस्कृतियों एक पथ्य प्रणाली है कि पशु अध्ययन की जटिलता को कम कर देता है प्रदान करते हैं.
प्रसव के बाद की मांसपेशियों से व्युत्पन्न मायोब्लास्ट्स का उपयोग अत्यधिक पुनरुत्पादक तरीके से कई उपचार और विकास की स्थिति के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसे लंबे समय से मान्यता दी जा रही है और मायोब्लास्ट अलगाव और संस्कृति के लिए अनेक विधियों का वर्णन4,5,6,7,8,9किया गया है . इन तरीकों में से कुछ नवजात मांसपेशियों का उपयोग करें और myoblasts5,8की अपेक्षाकृत कम संख्या उपज , बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए कई जानवरों की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, myoblasts culturing के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों का उपयोग करें “पूर्व चढ़ाना” myoblasts, जो अन्य सेल प्रकार की तुलना में कम अनुयायी हैं के लिए समृद्ध करने के लिए। हम वैकल्पिक संवर्धन विधि यहाँ वर्णित पाया है और अधिक कुशल और एक उच्च proliferative मायोब्लास्ट आबादी को समृद्ध करने के लिए reprodible हो. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल संस्कृति मीडिया में वृद्धि के माध्यम से, युवा वयस्क मांसपेशी explants से अत्यधिक proliferative मायोब्लास्ट के अलगाव सक्षम बनाता है. Myoblasts बार बार काटा जा सकता है, कई दिनों से अधिक, तेजी से विस्तार, और मायोट्यूब में अंतर करने के लिए प्रेरित किया. इस प्रोटोकॉल reproducibly स्वस्थ मायोब्लास्ट कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या है कि मजबूती से सहज twitching मायोट्यूब में अंतर उत्पन्न करता है. यह हमें चयापचय और circadian लय का अध्ययन करने के लिए सक्षम किया गया है जीनोटाइप की एक किस्म के चूहों की प्राथमिक मायोट्यूब में. अंत में, हम ऑक्सीडेटिव चयापचय के अध्ययन के लिए मायोट्यूब तैयार करने के लिए तरीकों में शामिल हैं, 96-वेल प्लेटों में ऑक्सीजन की खपत दरों की माप का उपयोग कर.
Protocol
Representative Results
Discussion
कंकाल की मांसपेशी चयापचय होमियोस्टेसिस11की स्थापना और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है . मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान का अध्ययन interindividual परिवर्तनशीलता से जटिल है, साथ ही नमूने प्राप्त करने में कठिना…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक मेलबोर्न विश्वविद्यालय में डॉ मैथ्यू वाट और जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय में डॉ अनास्तासिया Kralli के आभारी हैं मदद के लिए इस प्रोटोकॉल को अपनाने Mokbel एट अल6के काम पर आधारित है . हम भी विकास और हमारी प्रयोगशाला में इस प्रोटोकॉल को अपनाने की सहायता के लिए डॉ सबीन जॉर्डन धन्यवाद. इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान R01s DK097164 और DK112927 द्वारा K.A.L. के लिए वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
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