Isolering og differensiering av primær Myoblasts fra mus skjelettlidelser Muscle Explants

Summary

Myoblasts er voksende forløper celler som skiller å danne polynucleated myotubes og eventuelt skjelettlidelser muskel myofibers. Her presenterer vi en protokoll for effektiv isolering og kultur av primær myoblasts fra unge voksne mus skjelett muskler. Metoden muliggjør molekylær, genetisk, og metabolske studier av muskelceller i kulturen.

Abstract

Primær myoblasts er udifferensierte voksende forløpere for skjelettlidelser muskel. De kan være kultivert og studert som muskel forløpere eller indusert å differensiere i senere stadier av muskelutvikling. Protokollen gitt her beskriver en robust metode for isolering og kultur av en svært proliferativ befolkning på myoblast celler fra unge voksen mus Skjelettmuskel explants. Disse cellene er nyttige for studiet av metabolske egenskaper av skjelettmuskulatur av forskjellige musemodeller, så vel som i andre nedstrøms applikasjoner som transfeksjoner med eksogene DNA eller Transduction med viral uttrykk vektorer. Nivået av differensiering og metabolsk profil av disse cellene avhenger av lengden på eksponering, og sammensetningen av mediene som brukes til å indusere myoblast differensiering. Disse metodene gir et robust system for studiet av mus muskel celle metabolisme ex vivo. I motsetning til in vivo-modeller, er metodene beskrevet her gir en celle befolkning som kan utvides og studert med høye nivåer av reproduserbarhet.

Introduction

Mens ofte sitert som en indikasjon på total metabolsk helse, har flere studier vist at Body Mass Index (BMI) hos eldre voksne er ikke konsekvent forbundet med høyere risiko for dødelighet. Hittil, den eneste faktoren vist å være forenlig med redusert dødelighet i denne populasjonen er økt muskel masse¹. Muskel vev representerer en av de største kildene til insulin-sensitive celler i kroppen, og er derfor kritisk i vedlikehold av samlede metabolske homeostase². Aktivering av skjelettlidelser muskel vev via trening er forbundet med økninger i både lokale insulinfølsomhet og generell metabolsk helse³. Mens in vivo-modeller er avgjørende for å studere muskel fysiologi og virkningen av muskel funksjon på integrert metabolisme, primære kulturer av myotubes gi et medgjørlig system som reduserer kompleksiteten av dyrestudier.

Myoblasts avledet fra post-Natal muskler kan brukes til å studere virkningen av en rekke behandling og vekstforhold i en svært reproduserbar måte. Dette har lenge vært anerkjent og flere metoder for myoblast isolasjon og kultur har blitt beskrevet^4,5,6,7,8,9. Noen av disse metodene bruker nyfødte muskler og gir relativt lavt^{antall myoblasts,}som krever flere dyr for større skala studier. Også mest brukte metoder for dyrking myoblasts bruke “pre-plating” for å berike for myoblasts, som er mindre tilhenger enn andre celletyper. Vi har funnet den alternative berikelse metoden beskrevet her for å være mye mer effektiv og reproduserbar for berikende en svært proliferativ myoblast befolkning. Oppsummert muliggjør denne protokollen isolering av svært proliferativ myoblasts fra unge voksne muskel explants, via utvekst til kultur medier. Myoblasts kan høstes gjentatte ganger, over flere dager, raskt utvidet, og indusert å differensiere til myotubes. Denne protokollen reproduserbar genererer et stort antall sunne myoblast celler som robust differensiere til spontant rykninger myotubes. Det har gjort det mulig for oss å studere metabolisme og døgnrytme i primær myotubes av mus av en rekke genotyper. Til slutt inkluderer vi metoder for å utarbeide myotubes for studiet av oksidativt metabolisme, ved bruk av målinger av oksygen forbruks rater i 96 brønn plater.

Protocol

Denne protokollen følger dyre omsorgen retningslinjer for Scripps Research. 1. innsamling og bearbeiding av muskel vev Explants Dagen før disseksjon, sterilisere alt disseksjon utstyr (pinsett, barberblad og saks) og forberede alle nødvendige medier: fosfat bufret saltvann (PBS), MB plating Media (12,5 mL DMEM, 12,5 mL av SKINKE F12, 20 mL av varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS), 5 mL fostervann væske medium supplement), og coating løsning (24 mL DMEM, 24 mL SKINKE F12,…

Representative Results

Etter § 1 i den oppgitte protokollen skal gi primære celler dukker opp fra explants som vil være synlig under et standard lys mikroskop (figur 2). En heterogen celle befolkning vil bli sett vokser ut av og rundt hver muskel vev explant. Myoblasts vises som små, runde, lyse kuler. Etter § 2 i protokollen vil gi tidlige avlinger av myoblasts fra vev explants, som vil inneholde noen celler og vil være heterogen (Figur 3). § 3…

Discussion

Skjelettmuskel er avgjørende for etablering og vedlikehold av metabolske homeostase¹¹. Studiet av muskel fysiologi er komplisert ved interindividuelle variasjon, så vel som vanskeligheter med å skaffe prøver, spesielt i tilfelle av menneskelige studier. Kultivert primære myotubes har vist å recapitulate mange funksjoner i muskel fysiologi, inkludert kalsium homeostase¹², regenerering av skadede muskel vev⁵, metabolske forandringer som svar på …

Materials

Coating Solution:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
Collagen	Life Technologies	A1064401	1.7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
Plating Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Differentiation Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL
Heat Inactivated Horse Serum	Sigma	H1138	1.5 mL
Insulin-Selenium-Transferrin	Life Technologies	41400045	0.5 mL
Other Materials:
PBS	Gibco	14040133
Gentamicin	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells
Forceps	Any
Razor Blades	Any
Scissors	Any
Whatman paper	VWR	21427-648
60 mm plate	VWR	734-2318
10 cm plate	VWR	25382-428 (CS)
T25 Flasks	ThermoFisher	156367
T75 Flasks	ThermoFisher	156499
Centrifuge Tubes (15mL)	BioPioneer	CNT-15
Oxygen Consumption Rates:
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	Seahorse XFe96 Analyzer	Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	96-well plates for use in XFe96 Analyzer
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate	Agilent	102720-100	components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Palmitic acid	Sigma	P5585-10G	for measurement of fatty acid oxidation
carnitine	Sigma	C0283-5G	for measurement of fatty acid oxidation
Etomoxir	Sigma	E1905	for measurement of fatty acid oxidation
BSA	Sigma	A7030	used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation