Denne protokol billeder både den immunologiske synapse dannelse og den efterfølgende polariserede sekretoriske trafik mod den immunologiske synapse. Cellulære konjugater blev dannet mellem en super antigen-pulserende Raji-celle (fungerer som en antigen-præsenterer celle) og en Jurkat klon (fungerer som en Effector hjælper T lymfocyt).
Formålet med metoden er at generere en immunologisk synapse (IS), et eksempel på celle-til-celle konjugation dannet af en antigen-præsenterer celle (APC) og en Effector hjælper T lymfocyt (th) celle, og til at registrere de billeder, der svarer til de første stadier af ER dannelse og de efterfølgende menneskehandel begivenheder (forekommer både i APC og i th-cellen). Disse begivenheder vil i sidste ende føre til polariseret sekretion på IS. I denne protokol, jurkat celler udfordret med Staphylococcus enterotoksiner E (Se)-pulserende Raji celler som en celle synapse model blev brugt, på grund af den nærhed af dette eksperimentelle system til den biologiske virkelighed (th Cell-APC synaptisk konjugater). Den fremgangsmåde, der præsenteres her involverer celle-til-celle konjugering, time-lapse erhvervelse, Wide-felt Fluorescens mikroskopi (WFFM) efterfulgt af billedbehandling (efter erhvervelse devolution). Dette forbedrer signal-til-støj-forholdet (SNR) af billederne, forbedrer den tidsmæssige opløsning, giver mulighed for synkroniseret erhvervelse af flere fluorokromer i spirende synaptiske konjugater og nedsætter fluorescens blegning. Desuden er protokollen godt afstemt med slutpunkts-celle fikserings protokollerne (PARAFORMALDEHYD, acetone eller methanol), hvilket vil give mulighed for yderligere immunofluorescens farvning og analyser. Denne protokol er også kompatibel med Laserscanning confokal mikroskopi (lscm) og andre State-of-the-art mikroskopi teknikker. Som en vigtigste advarsel, kun de T Cell-APC grænser (kaldet er grænseflader), der var på den rigtige 90 ° vinkel til fokus flyet langs Z-aksen kunne være korrekt afbildet og analyseret. Der findes andre eksperimentelle modeller, som forenkler billeddannelse i Z-dimensionen og følgende billedanalyser, men disse tilgange emulerer ikke den komplekse, uregelmæssige overflade af et APC og kan fremme ikke-fysiologiske interaktioner i IS. Således er den eksperimentelle tilgang, der anvendes her, egnet til at reproducere og til at konfrontere nogle biologiske kompleksiteter, der forekommer på IS.
Hovedformålet med metoden er at generere immunologiske synapse (IS) celle-til-celle konjugater dannet af en antigen-præsenterer celle (APC) pulserende med Se super antigener og en Effector th celle, og for at registrere de billeder, der svarer til de første stadier af immunologisk synapse dannelse og den efterfølgende handel begivenheder (forekommer både i APC og th-cellen), som i sidste ende vil føre til polariseret sekretion på IS. Etableringen af is ved T-lymfocytter ved binding af deres celle receptor (TCR) til antigener bundet til MHC-II på APC organiserer en ekstremt dynamisk, formbart og kritisk tilfælde involveret i antigen-specifikke, humorale og cellulære immunrespons1,2. Den er defineret ved dannelsen af et særligt Supramolekylær aktiverings kompleks (SMAC) mønster karakteriseret ved en actin reorganisation proces3. Ved er konstruktion af T-lymfocytter med en APC, polariseringen af de sekretoriske vesikler mod er synes at være impliceret i polariseret sekretion på den synaptiske kløft. Dette fokuserede maskineri synes utvetydigt at forsyne immunsystemet med en fremragende reguleret List for at øge effektiviteten af kritiske sekretoriske Effector roller af T-lymfocytter, samtidig med at ikke-specifik, cytokin-arbitrated stimulation af tilskuer celler, drab af irrelevante målceller og apoptotisk selvmord via aktiverings induceret celledød (aicd)4.
Konsekvensen af er varierer afhængigt af arten af både T-lymfocyt og APC. Den synaptiske kontakt af th celler (typisk CD4 + celler) med APC viser antigen-associeret til MHC-II producerer aktivering af T-cellen (cytokin sekretion, proliferation, etc.) og, i nogle tilfælde, apoptose via AICD4. For cytotoksiske T-lymfocytter (CTLs) (hovedsageligt CD8 + celler), der interagerer med APC, som præsenterer antigen associeret med MHC-I, er resultatet forskelligt på præ-stimulation eller ikke af CTL’erne med antigen. Således, naive CTLs identificere antigen-MHC-I komplekser på APC er “primet” at ødelægge Target celler og kløft. Primet CTLS også etablere synapser med målceller (dvs. celler inficeret med vira eller tumorceller) producerer antigen-specifikke celle udryddelsen5,6.
Den polariserede sekretion af exosomer ved den immunologiske synapse er et udviklings-og udfordrende område for forskning, der er involveret i relevante immunrespons7. Det er blevet påvist, at multivesikulære organer (mvb), der transporterer intraluminal vesikler (ilvs), har polariseret transport mod is8,9 (video 1) ved TCR stimulation med antigen. Fusionen af disse mvb på den synaptiske membran inducerer deres degranulering og frigivelsen af ilvs som exosomer til den synaptiske kløft8,10. Dette sker i er dannet af th-type Jurkat celler, der blev udfordret med Se super antigen-coated Raji celler fungerer som APC11, TCR-stimuleret CD4+ Lymfoblaster, og primet CTLS. Således synapser lavet af Jurkat celler udgør en værdifuld model til at studere polariseret sekretoriske trafik af exosomer. Desuden har flere årtier af undersøgelsen vist, at mange grundlæggende indsigt i TCR signalering kom fra undersøgelser med transformerede T-cellelinjer, og faktisk den bedst kendte af disse modelsystemer er Jurkat leukæmi T-Cell linje12.
Dannelsen af en fuldt udviklet er producerer flere afgørende biologiske resultater, herunder aktivering af th celler, aktivering af naive CTLS eller Target Cell drab ved primet CTLS, bortset fra Anergi eller aicd5. Derfor er der to store typer af sekretoriske er etableret af T-lymfocytter, der resulterer i meget forskellige, men ligeledes kritisk, immun Effector funktioner1,6,13. På den ene side, er fra primet cytotoksiske T lymfocytter (CTLS) inducerer hurtig polarisering (spænder fra sekunder til få minutter) af lytisk granulat (kaldet “sekretoriske lysosomer”) mod is. Degranulering af det lytiske granulat inducerer sekretionen perforin og granzymes til den synaptiske kløft14, som er Pro-apoptotiske molekyler. De udskillede perforin-og granzymes fremkalder efterfølgende aflivning af målcellerne15,16. CTLS udvikler midlertidige synapser, der kun varer få minutter, da målcellerne myrdes3,17. Dette er sandsynligvis på grund af den omstændighed, at den optimale CTL opgave kræver en hurtig og midlertidig kontakt for at distribuere så mange dødbringende strejker som muligt til talrige mål celler3,17. I modsætning hertil, th lymfocytter såsom jurkat celler generere stabile, langvarige er (fra 10-30 min op til timer), da dette synes at være nødvendigt for både retningsbestemt og uophørligt sekretion af stimulerende cytokiner3,17. Cytokinerne er også omsluttet af sekretoriske vesikler, og nogle af dem (dvs. IL-2, IFN-γ) oplever polariseret transport til er17 og sekretion. Et væsentligt kendetegn ved IS er dannelsen af sonderende, svage og forbigående kontakter mellem T-cellen og APC (video 1), der kan skabe en stærkere interaktion og etablering af en moden er, forudsat at TCR identificerer de cognate antigen-MHC komplekser, og at passende Co-stimulerende forbindelser er etableret5. Både begyndelsen af de indledende kontakter og grundlæggelsen af en moden, helt produktiv er, er i sagens natur stokastiske, hurtige og asynkrone processer5,18. Desuden er der en begrænset hyppighed i skabelsen af celle-til-celle konjugater19, som kan udgøre en udfordring for billeddannelsesteknikker (se resultater og diskussions sektioner).
En anden Hovedudfordring i at undersøge polarisering af microtubule-organisere Center (MTOC) og sekretoriske granulat i T-lymfocytter er, at hele processen er hurtig (sekunder til få minutter), især i CTLs. i betragtning af disse kendsgerninger, de fleste tidlige tilgange konfronteret en slutpunkt strategi, hvor APC/Target-celler og T-lymfocytter blandes i fællesskab og konvergeret ved lav hastighed centrifugering, at favorisere celle-til-celle konjugation skabelse, inkuberet i flere minutter, fast og efterfølgende evalueret for flytning af MTOC og/eller sekretoriske vesikler mod20. Denne fremgangsmåde har to væsentlige begrænsninger: ingen livlige menneskehandel data blev opnået, og høje niveauer af baggrund MTOC/secretory granulat polarisering blev opnået, sandsynligvis på grund af den stokastiske karakter af er etablering18. Desuden er enhver sammenhæng mellem TCR-stimuleret, indledende signalering hændelser (dvs. intracellulære calcium stigninger, actin reorganisering) og sekretoriske vesikelprotein polarisering problematisk at undersøge. Derfor er det bydende nødvendigt at fastsætte bestemmelser om passende billeddannelse er i levende celler kombineres for at forbedre celle-til-celle konjugat materialisering, at synkronisere genereringen af IS og, når det er muligt, at sikre etableringen af cellulære konjugater på definerede mikroskopet XY felter og Z positioner. Flere strategier er blevet udviklet for at undgå alle disse problemer. Det er ikke omfattet af dette dokument til at forklare disse metoder, deres fordele og svagheder. Se de tidligere offentliggjorte anmeldelser, som tackler disse vigtige punkter1,4,5,21.
Det faktum, at er lavet af th lymfocytter er langlivet, og den omstændighed, at i th lymfocytter MTOC, lymfoktin-holdige sekretoriske granulat og MVB tage fra flere minutter op til timer til at flytte og dock til er22 gør th-APC er en ideel kandidat til billeddannelse ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her.
En begrænsning af denne protokol er, at ikke alle synapser vil være ideelt orienteret vinkelret på den optiske akse. Ved hjælp af denne teknik, er der ingen måde at forudsige og/eller til at påvirke den ideelle orientering for immun synapse Imaging. For at løse dette problem, udelukker vi fra de efterfølgende analyser alle de tilfældigt erobrede synapser, der endelig ikke opfylder de ideelle kriterier. Disse synapser, belejligt nok, er ikke meget hyppige. Det er dog muligt at omgå denne begrænsning ved hjælp af flere eksperimentelle tilgange4.
Den polariserede CD63 frigivelse (degranulering) kan kvantificeres ved andre komplementære teknikker såsom celleoverfladen farvning af CD63 (CD63 flytning til cellens overflade) i levende celler (ikke fast og ikke permeabilized), efter trin 6, og efterfølgende vask og fiksering, som tidligere vist8. Desuden, CD63 frigivelse på exosomerne8,9 og exosomvesikler kvantificering af nanopartikel tracking analyser9,25 kan udføres. Disse tilgange er helt sikkert forenelige med vores protokol, forudsat fiksering udføres efter celleoverfladen immunofluorescenstest af levende celler.
Vi har fundet det ideelle antal celler (for en 1 cm2 brønd i 8-brønden kammer slide) er 4 x 105 celler (2 x 105 Raji celler og 2 x 105 jurkat celler), da de holder sig effektivt til bunden af brønden. Bindende effektivitet til plast (ved hjælp af fibronectin), eller glasbund (ved hjælp af poly-L-lysin) mikroslides er normalt ikke et problem. Højere celle tal kan ikke give nogen huller blandt klæbet celler og derefter komplekse synaptiske konjugater (figur 1); begge situationer er ikke ønskeligt, når enkelt celle-til-celle konjugater skal afbildet i, for eksempel, MTOC eller sekretoriske granulet polarisering eksperimenter. Lavere antal celler kan mindske chancerne for at finde konjugater, især når transficeret jurkat celler udfordres med APC til at generere synapser. Bemærk venligst, at vi har observeret, at en temperatur stabiliseret fase inkubator på plads på mikroskopet X/Y fase før starten af protokollen (dvs., 1-2 h på forhånd for at stabilisere scenen/mikroskopet setup) opretholder stabile X, y, Z parametre, som er afgørende for korrekt billeddannelse. Automatisk fokus system vil i sidste ende kompensere små Z variationer.
Når visse gentransduktion teknikker såsom elektroporation bruges til at udtrykke fluorescerende chimeriske proteiner (dvs. GFP-CD63) i Jurkat kloner (video 1), en betydelig brøkdel af celler kan dø efter elektro poration. Dette kan være et problem, da selvdøde celler ikke danner synapser, når de er overskydende over de levende, transficeret celler, de kan forstyrre dannelsen af konjugater lavet af levende th celler. Vi har fundet, at omhyggelig eliminering af døde celler fra transficeret kulturer ved hjælp af en tæthed gradient medium efter standardprotokoller, før konjugat dannelse skridt kan faktisk øge chancerne for korrekt billede konjugater. Desuden har lave transfektering effektivitetsgevinster (< 20%) kan være en vigtig advarsel, da dette, kombineret med en moderat konjugat dannelse effektivitet (omkring 60%)25, vil mindske sandsynligheden for at finde konjugater lavet af transficeret celler. Dette er ikke et problem, når ikke-transfected celler bruges til at opnå konjugater i slutpunkt eksperimenter og efterfølgende fiksering. De 8 strips med mikrobrønde kammer slides er kompatible med konventionelle immunofluorescens protokoller. Dette øger fleksibiliteten i ovenstående protokol med forskellige formål. Fiksering med acetone kan være et problem at overveje, når du bruger kammer glider med plastik bund brønde. Men der er kommercielt tilgængelige 8 strips med mikrobrønde mikroskop kammer glider indeholdende glas bunde, som er kompatible med acetone fiksering. Fjern plastik låg, når acetone bruges til at fastsætte cellerne, der dyrkes i 8 strips med mikrobrønde Glass-bottom kammer slides.
Det anbefales, at mikroskop er udstyret med en motoriseret XY Stage, motoriseret EPI-fluorescens tårn og automatisk fokus system (f. eks. perfekt fokus system) eller tilsvarende kosttilskud. Når multi-Well erhvervelse er påkrævet25, vil det automatiske fokus system sikre et stabilt fokus hele vejen gennem eksperimentet. Tidligere erfaring indikerer, at ved at etablere en passende fokus offset på de Raji celler, kan både bevægelsen af T-celler (video 1) og mikroskopet fase/kammer slide bevægelser i XY multi-punkt eksperimenter, kompenseres. Dette er faktisk bekvemt for multiwell time-lapse Capture.
En sort og hvid, panchromatisk og afkølet opladet koblet enhed (CDD) kamera blev brugt, men højere følsomhed, fluorescens videnskabelige komplementære metal-oxid halvleder (sCMOS) kamera er ønskelig, da dette vil mindske kameraets eksponeringstider og vil forbedre tidsmæssig opløsning. Den korte kamera eksponering gange vi har brugt (ranking form 100 MS til 500 MS) kombineret med den automatiske fluorescens lukker tillader langvarig tid lapse Capture (op til 24 h) med en passende tidsopløsning (1 frame per minut eller mindre, for op til 16 XY positioner) uden signifikant fluorescens blegning og/eller tab i cellernes levedygtighed. Den motoriserede fase tillader multi-point (XY) Capture og øger chancen for at finde og billede de spirende og udvikle synapser i den ideelle orientering, men også tillader billed erhvervelse i multiwell kammer slides, når forskellige Jurkat kloner skal samtidig konjugeret25. Høj numerisk blænde af målet (dvs. 60x, 1,4) er nødvendig for at opnå de bedste resultater ved analyse af trafikken af sekretoriske granulat.
RAJI-SEE-Jurkat udgør en veletableret immunologisk synapse model, der er blevet brugt af et utal af forskere, da det oprindeligt blev beskrevet11. Vi har tilpasset vores protokol til denne model for at korrekt billede de tidlige stadier af IS formation. Vores mål var at forbedre de tidlige tilgange20 tidligere fulgt for at studere polariseringen af MTOC og sekretoriske maskineri mod is. Det er bemærkelsesværdigt, at konjugater lavet med denne protokol producere F-actin reorganisering på synapse, konfiguration af en kanonisk SMAC, samtidig med MVB polariseret trafik25. Disse afgørende begivenheder er også blevet analyseret og valideret af confokal mikroskopi25.
Kinetiske forskelle i polariseret trafik findes blandt forskellige typer af IS. For eksempel foregår den polariserede transport af lytisk granulat fra CTLs på få sekunder eller meget få minutter, mens flere cytokinholdige vesikler fra th-lymfocytter tager fra minutter op til flere timer for at afslutte. Disse tidsmæssige forskelle skal tages i betragtning på forhånd, for at designe den bedste strategi og vælge den mest hensigtsmæssige eksperimentel og billedbehandlings metode, da for nogle billedbehandlings kneb (dvs. Laserscanning confokal mikroskopi (lscm)), kan tiden være en begrænsende faktor, da Capture tid er meget højere end den passende tidsopløsning (1 min eller mindre)4. Dette er ikke en begrænsning, når Wide-felt Fluorescens mikroskopi (WFFM) anvendes som beskrevet i protokollen ovenfor. Da i CTLS, polariseringen af MTOC mod synapse varer kun et par minutter3,6,17, forskellige specifikke State-of the art mikroskopi tilgange forskellige til, der er beskrevet her (men harkedeligt højere rumlig og tidsmæssig opløsning) er nødvendige for at korrekt billede disse synapser26,27, især når flere mikroskop felter (multi-point Capture) er afbildet. Disse høj opløsning, nye tilgange kan også udnyttes til billeddannelse synapser fremstillet af th lymfocytter, selv om økonomiske og/eller logistiske årsager (dvs. det centrale udstyr, der kræves for nogle af disse Imaging teknikker omkostninger 6-7 gange mere end den beskrevne her) kunne helt sikkert udgøre en begrænsning for disse State of the art Imaging metoder4. Det faktum, at er lavet af th lymfocytter er langlivet, og den omstændighed, at i th lymfocytter MTOC, de lymfoktin-holdige sekretoriske vesikler og MVB tage fra flere minutter op til timer til transport og dock til er22, gør denne protokol en ideel, overkommelig tilgang til billeddannelse th-APC er.
WFFM i kombination med efter købet billede dekoncentrering udgør en interessant tilgang, og ikke kun økonomiske årsager støtte denne strategi. Den iboende dårlige opløsning i Z-aksen (den vigtigste advarsel af teknikken) kan forbedres ved at bruge post-erhvervelse billede devolution4 (Sammenlign video 1 med video 2). Dekoncentrering bruger en beregningsbaseret, billedbehandlings metode, der kan forbedre signal-og støjforhold og billedopløsning og kontrast27 op til 2 gange, ned til 150-100 nm i XY-akse og 500 nm i Z-aksen4.
Brugen af højere følsomhed, høj udlæsninghastighed og bredt dynamisk område, nye fluorescens sCMOS-kameraer vil forbedre kvaliteten af billederne og vil reducere fluorescens blegning. Den fleksibilitet, der tilbydes af celle-til-celle konjugering protokol beskrevet her gør det muligt at kombinationen af den beskrevne cellulære tilgang med flere state of the art mikroskopi teknikker, både i levende celler, men også i faste celler, og det forventede resultat vil faktisk forbedre vores viden om den immunologiske synapse.
Selv om vi har implementeret og valideret protokollen ved hjælp af let at håndtere, veletablerede cellelinjer, potentialet tilgangen kan tillade visualisering af mere fysiologiske interaktioner, når primære T-celler og forskellige typer af antigen-præsenterer celler (såsom dendritiske celler af makrofager) anvendes5. I denne forbindelse er denne protokol også blevet udvidet og valideret ved anvendelse af super antigen (SEB)-pulserende mus EL-4-cellelinje, der anvendes som et APC, til at udfordre primær mus T-Lymfoblaster9. Faktisk primære T-lymfocytter, CTLs i særdeleshed, gjort mere kortvarige og dynamiske synaptiske kontakter (Se supplerende video 8 i reference9) til dem, der ses med See-Raji og jurkat model. Variabiliteten af synaptiske kontakt tilstande kan bedst ses for primære T-celle interaktioner med dendritiske celler eller B-celler i to-dimensionelle in vitro-vævs ækvivalenter, der også kan optages og analyseres ved hjælp af denne protokol. Hertil kommer, bortset fra Super antigener, teknikken kan bruges til at afbilde andre typer af synapser. For eksempel, det kunne anvendes i en TCR transgene, antigen-specifik T celle model, for eksempel ved hjælp af ægalbumin specifikke murine OT1/OT2 system eller ved transfektering af t-celler med antigen-specifikke t celle receptorer. Dette åbner et utal af eksperimentelle muligheder for den umiddelbare fremtid.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender alle de tidligere og nuværende medlemmer af laboratoriet for deres generøse bidrag. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den spanske Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), plan Nacional de Investigación Científica (SAF2016-77561-R til M.I., som delvis blev ydet med FEDER-EF-finansiering). Vi anerkender Facultad de Medicina (UAM) og Departamento de Audiovisuales fra Facultad de Medicina for deres støtte og de faciliteter, der leveres til at producere videoen. Vi anerkender NIKON-Europe for den kontinuerlige og fremragende tekniske og teoretiske støtte. Fri adgang til denne artikel er sponsoreret af Nikon.
Camera Nikon DS-QI1MC | Nikon | MQA11550 | Cooled Camera Head |
CMAC | ThermoFisher Scientific | C2110 | Cell tracker blue |
JURKAT cells | ATCC | ATCC TIB-152 | Effector T lymphocytes |
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom | IBIDI | Cat.No: 80826, 80827 | Cell culture and cell imaging supports |
Microscope NIKON Eclipse Ti-E | Nikon | NIKON Eclipse Ti-E | Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | Cell culture atmosphere |
Raji Cells | ATCC | ATCC CCL-86 | APC |
RPMI medium GIBCO | ThermoFisher Scientific | 21875034 | Culture medium |
Streptococcus Enterotoxin E (SEE) | Toxin Technology, Inc | EP404 | Bacterial Toxin |
Software Huygens Essential | SVI | Huygens Essential | Image Deconvolution software |
Software Image J | NIH | Image J | Image software |
Software Nikon NIS-AR | Nikon | NIS-Elements AR | Image capture and analysis software |