मानवीकृत इम्यूनोडेफिजेंट माउस मॉडल में क्रोनिक, एक्यूट और रीएक्टिवेटेड एचआईवी संक्रमण
Summary
यहां वर्णित मानवीकृत चूहों में एचआईवी संक्रमण की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए तीन प्रयोगात्मक दृष्टिकोण हैं । पहला पुरानी संक्रमण घटनाओं के अध्ययन की अनुमति देता है, जबकि दो उत्तरार्द्ध प्राथमिक संक्रमण या वायरल पुनर्सक्रियण के बाद तीव्र घटनाओं के अध्ययन के लिए अनुमति देता है।
Abstract
मानवीकृत NOD/SCID/IL-2 रिसेप्टर-चेननल चूहों मानव प्रतिरक्षा की कुछ विशेषताओं को संक्षिप्त करता है, जिसका संक्रामक रोगों पर बुनियादी और पूर्व नैदानिक अनुसंधान में शोषण किया जा सकता है । यहां वर्णित एचआईवी संक्रमण की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए मानवीकृत प्रतिरक्षा चूहों के तीन मॉडल हैं । पहला नवजात चूहों में CD34+ हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं के इंट्राहेपेटिक इंजेक्शन पर आधारित है, जो कई रक्त और लिम्फोइड ऊतक-सीमित कोशिकाओं के पुनर्गठन के लिए अनुमति देता है, जिसके बाद संदर्भ एचआईवी तनाव के साथ संक्रमण होता है। यह मॉडल संक्रमण के बाद 36 सप्ताह तक निगरानी की अनुमति देता है और इसलिए इसे पुरानी मॉडल कहा जाता है। दूसरे और तीसरे मॉडल को तीव्र और पुनर्सक्रियण मॉडल के रूप में जाना जाता है, जिसमें परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को वयस्क चूहों में इंट्रापेरिटोनी इंजेक्शन दिया जाता है। तीव्र मॉडल में, एक स्वस्थ दाता से कोशिकाओं को इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से engrafted किया जाता है, जिसके बाद संदर्भ एचआईवी तनाव के साथ संक्रमण होता है। अंत में, पुनर्सक्रियण मॉडल में, एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी के तहत एचआईवी संक्रमित दाता से कोशिकाओं को इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से संजोर्गेटेड किया जाता है। इस मामले में, माउस में एक दवा मुक्त वातावरण वायरस पुनर्सक्रियण और वायरल लोड में वृद्धि के लिए अनुमति देता है। यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल एचआईवी संक्रमण के मानवीकृत, इम्यूनोडिफिजेंट माउस मॉडल के लिए पारंपरिक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं ।
Introduction
मानवीकृत NOD/SCID/interleukin (IL)-2 रिसेप्टर-चेननल (इसके बाद huNS के रूप में संदर्भित श्रृंखलानल)माउस मॉडल व्यापक रूप से संक्रमण, ऑटोइम्युनिटी, और कैंसर के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, साथ ही दवाओं और मानव सेल आधारित चिकित्सा1,2के पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए । ये चूहे एक गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (NOD) पृष्ठभूमि पर आधारित हैं, जिसमें आईएल-2 रिसेप्टर-चेन लोकस (आईएल-2, आईएल-4, आईएल-7, आईएल-9, आईएल-15 और आईएल-21 के लिए आम-श्रृंखला) में स्सिड म्यूटेशन और लक्षित उत्परिवर्तन के साथ, जो माउस टी-, बी-, और प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओंकेविकास में गंभीर हानि को प्रेरित करता है । इस प्रकार, वे मानव ऊतक, मानव सीडी 34+ हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) और मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs)3,4,5के एनग्राफमेंट का समर्थन करते हैं। इसके अलावा, स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ), ग्रैनुलोसाइट/मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) जैसे मानव हेमेटोपोइटिक कारकों की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति, और आईएल-3 मानव माइलॉयड आबादी6,7,8के एनग्राफमेंट को बढ़ावा देता है ।
एचआईवी अध्ययन के लिए, कई huNS-श्रृंखलानल माउस मॉडल का वर्णन किया गया है, जो माउस तनाव में अलग, मानव कोशिकाओं के प्रकार का इस्तेमाल किया, engraftment के लिए ऊतकों के प्रकार, और कोशिकाओं की उत्पत्ति (यानी, स्वस्थ बनाम। एचआईवी संक्रमित दाता)9,10. मूल तनाव, हालांकि, मानव कोशिकाओं के उच्च स्तर के कारण व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और संक्रमण के बाद वायरल प्रतिकृति का उपयोग किया जाता है, जिसमें संदर्भ एचआईवी तनाव11,12,13होता है। मानव हेमेटोपोइटिक कारकों की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के साथ इसी तरह के इम्यूनोडिफिएंट माउस उपभेदों (उदाहरण के लिए, NOG-EXL या NSG-SGM3) या मानव जिगर और थाइमस ऊतकों (बोन मैरो-यकृत-थाइमस [BLT] चूहों) के प्रत्यारोपण के साथ एचआईवी रोधी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में माइलॉयड आबादी की भूमिका का मूल्यांकन करने, इन ऊतकों पर एचआईवी के प्रभाव, और वायरल जलाशयों के रूप में उनकी भागीदारी14,15के लिए उपयोगी हैं । इसके अलावा, मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) अणुओं की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के साथ कुछ उपभेदों, साथ ही बीएलटी चूहों का उपयोग एचआईवी संक्रमण16,17के लिए टी-सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
सामान्य तौर पर, इन चूहों में, मानवीकरण सेलुलर मूल, वितरण मार्ग (इंट्रापेरिटोनियल, इंट्राहेपेटिक, नसों, इंट्राकार्डियक) औरमाउस उम्र पर निर्भर करताहै। कोशिका मूल के बारे में, मानव CD34+ एचएससी गर्भनाल रक्त, भ्रूण जिगर, या जुटाए परिधीय रक्त से प्राप्त नवजात शिशु या युवा चूहों3,21में इंजेक्शन किया जा सकता है । इसके अलावा, वयस्क-चेननल चूहों को पीबीएमसी (यहां, जिसे हू-पीबीएल-एनएस-चेननल चूहों के रूप में जाना जाता है) के इंजेक्शन द्वारा मानवीय कृत किया जा सकता है, जिससे रक्त में इन कोशिकाओं के अस्थायी परिसंचरण, द्वितीयक लिम्फोइड अंग, और सूजनऊतक22,23,24।
यहां वर्णित एचआईवी संक्रमण के अध्ययन के लिए huNS कीस्थापना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है। पहला पुराना मॉडल है, जिसमें एक स्वस्थ दाता से गर्भनाल रक्त से प्राप्त मानव CD34+ HSCs नवजात चूहों में इंजेक्शन हैं, मानव प्रतिरक्षा प्रणाली पुनर्गठन के 14 सप्ताह के बाद एक संदर्भ एचआईवी तनाव के साथ संक्रमण के बाद । यह मॉडल संक्रमण के बाद ~ 36 सप्ताह तक चूहों की निगरानी की अनुमति देता है। दूसरा मॉडल एक तीव्र मॉडल है, जिसमें एक स्वस्थ दाता से प्राप्त पीबीएमसीएस वयस्क एनएस-चेननल चूहों में इंजेक्ट किए जाते हैं, इसके बाद माउस में मानव टी-सेल विस्तार के 3 सप्ताह के बाद संदर्भ एचआईवी तनाव के साथ संक्रमण होता है। अंत में, तीसरा मॉडल पुनर्सक्रियण मॉडल है, जिसमें दमनकारी एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (एआरटी) के तहत एचआईवी संक्रमित दाता से प्राप्त पीबीएमसीएस वयस्क एनएस-चेननल चूहों में इंजेक्ट किए जाते हैं। इस मामले में, एक दवा मुक्त वातावरण वायरल पुनर्सक्रियण और वायरल लोड में वृद्धि के लिए अनुमति देता है। दो बाद मॉडल engraftment के बाद ~ 9 सप्ताह तक के लिए निगरानी की अनुमति देते हैं ।
कुल मिलाकर, ये तीन मॉडल विषाणु अध्ययन, उपन्यास दवाओं के पूर्व-नैदानिक अध्ययन, और वैश्विक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर एचआईवी संक्रमण प्रभावों के मूल्यांकन के लिए उपयोगी हैं। यह भी विचार करना महत्वपूर्ण है कि एचआईवी संक्रमित मानवीकृत चूहों के उपयोग के लिए किसी भी प्रयोग से पहले संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) के साथ-साथ संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा समीक्षा और अनुमोदन की आवश्यकता होती है । यह सुनिश्चित करता है कि अध्ययन खतरनाक जैविक सामग्री के उपयोग और प्रयोगात्मक जानवरों की मानवीय हैंडलिंग के लिए सभी आंतरिक और बाहरी संस्थागत नियमों का पालन करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानवीकरण के लिए इम्यूनोडिफेंट माउस उपभेदों के विकास में महत्वपूर्ण प्रगति हासिल की गई है, जिसमें कई विभिन्न विकल्प हैं जिनका उपयोग अनुसंधान हित1के अनुसार किया जा सकता है। बशर्ते यहां एचआईवी …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को आईएचवी क्लीनिकल डिवीजन इंटरनल फंड्स ने जेसीजेड को सपोर्ट किया था ।
Materials
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
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