Kronisk, akut, och återaktiveras HIV-infektion i humaniserade Immunobristfälliga musmodeller
Summary
Beskrivs här är tre experimentella metoder för att studera dynamiken i HIV-infektion i humaniserade möss. Den första tillåter studier av kroniska infektions händelser, medan de två sistnämnda möjliggör studiet av akuta händelser efter primär infektion eller viral reaktivering.
Abstract
Humaniserad NOD/SCID/IL-2 receptor γ-kedjaNull möss recapitulate vissa funktioner av mänsklig immunitet, som kan utnyttjas i grundläggande och preklinisk forskning om infektionssjukdomar. Beskrivs här är tre modeller av humaniserade immunobristfällig möss för att studera dynamiken i HIV-infektion. Den första är baserad på den intrahepatiska injektionen av CD34+ hematopoietiska stamceller hos nyfödda möss, vilket gör det möjligt för beredning av flera blod och lymfoida vävnad-trånga celler, följt av infektion med en referens hiv-stam. Denna modell möjliggör övervakning i upp till 36 veckor efter infektion och kallas därför för den kroniska modellen. Den andra och tredje modellen kallas för akuta och reaktiveringsmodeller, där perifera mononukleära blodceller injiceras intraperitonealt hos vuxna möss. I den akuta modellen, celler från en hälsosam donator inympas genom intraperitoneal väg, följt av infektion med en referens HIV-stam. Slutligen, i reaktive rings modellen, celler från en HIV-infekterad givare under antiretroviral behandling inympas via den intraperitoneala rutten. I detta fall, en drogfri miljö i musen möjliggör virus reaktivering och en ökning av virusbelastningen. De protokoll som anges här beskriver den konventionella experimentella metoden för humaniserade, immunobristfälliga musmodeller av HIV-infektion.
Introduction
Den humaniserade NOD/SCID/interleukin (IL)-2 receptor γ-ChainNull (hädanefter kallad Huns γ-ChainNull) musmodell har använts i stor utsträckning för att studera patogenesen av infektioner, autoimmunitet, och cancer, samt för prekliniska studier av läkemedel och mänskliga cellbaserade terapier1,2. Dessa möss är baserade på en icke-feta diabetisk (NOD) bakgrund, med scid -mutation och riktad MUTATION vid Il-2-receptorn γ-Chain Locus (vanlig γ-kedja för Il-2, Il-4, Il-7, Il-9, Il-15 och Il-21), som inducerar en allvarlig försämring i utvecklingen av mus T-, B-, och Natural Killer (NK) celler1. Sålunda, de stöder engrafering av mänsklig vävnad, Human CD34+ hematopoietiska stamceller (hscs), och mänskliga perifera blod mononukleära celler (pbmcs)3,4,5. Dessutom, transgena uttryck för mänskliga hematopoietiska faktorer, såsom stamcells faktor (SCF), granulocyt/makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF), och Il-3 främjar inympning av mänskliga myeloida populationer6,7,8.
För HIV-studier, flera huNS γ-ChainNull musmodeller har beskrivits, som skiljer sig i musen stam, typ av mänskliga celler som används, typ av vävnader för inympning, och ursprunget av celler (dvs., friska vs. HIV-infekterad donator)9,10. Den ursprungliga stammen, dock, används ofta på grund av de höga nivåerna av mänskliga celler engrafktion och viral replikering efter infektion med en referens hiv-stam11,12,13. Liknande immunbristfälliga mus stammar med transgena uttryck av humana hematopoetiska faktorer (t. ex. nog-EXL eller NSG-SGM3) eller med implantat av mänskliga levern och bräss vävnader (benmärg-lever-tymus [blt] möss) är användbara för att utvärdera rollen av myeloida populationer i anti-hiv immunsvar, effekter av hiv på dessa vävnader, och deras deltagande som virala reservoarer14,15. Dessutom kan vissa stammar med transgena uttryck av humant leukocytantigen (HLA) molekyler, liksom BLT möss, användas för att studera T-cells svar på hiv-infektion16,17.
I allmänhet, i dessa möss, humanisering beror på cellulär ursprung, leverans rutt (intraperitoneal, intrahepatisk, intravenös, intracardiac) och mus ålder vid tidpunkten för engrafation18,19,20. När det gäller cell ursprung, Human CD34+ HSC härrör från navelsträngsblod, foster levern, eller mobiliserade perifera blod kan injiceras i nyfödda eller unga möss3,21. Dessutom, vuxna γ-ChainNull möss kan humaniseras genom injektion av PBMC (här, kallad hu-PBL-ns γ-ChainNull möss), vilket gör att den temporala cirkulationen av dessa celler i blodet, sekundära lymfoida organ, och inflammerade vävnader22,23,24.
Beskrivs här är ett detaljerat protokoll för upprättande av huNS γ-kedjaNull musmodeller för studiet av hiv-infektion. Den första är den kroniska modellen, där Human CD34+ hscs härrör från navelsträngsblod från en hälsosam donator injiceras i nyfödda möss, följt av infektion med en referens hiv-stam efter 14 veckor av människans immunsystem beredning. Denna modell möjliggör övervakning av möss i upp till ~ 36 veckor efter infektion. Den andra modellen är en akut modell, där PBMCs härrör från en frisk givare injiceras i vuxen NS γ-kedjaNull möss, följt av infektion med en referens hiv-stam efter 3 veckors mänsklig T-cell expansion i musen. Slutligen, den tredje modellen är reaktive rings modellen, där PBMCs härrör från en HIV-infekterad givare under suppressiv antiretroviral behandling (ART) injiceras i vuxen NS γ-kedjaNull möss. I detta fall, en drogfri miljö möjliggör viral reaktivering och ökning av virusbelastningen. De två senare modellerna tillåter övervakning i upp till ~ 9 veckor efter inympning.
Sammantaget dessa tre modeller är användbara för virologiska studier, prekliniska studier av nya läkemedel, och utvärdering av HIV-infektion effekter på det globala immunförsvaret. Det är också viktigt att tänka på att användningen av HIV-infekterade humaniserade möss kräver granskning och godkännande av den institutionella Biosäkerhetskommittén (IBC) samt av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) innan något experiment. Detta säkerställer att studien följer alla interna och externa institutionella föreskrifter för användning av farligt biologiskt material och human hantering av försöksdjur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viktiga framsteg har uppnåtts i utvecklingen av immunobristfälliga mus stammar för humanisering, med ett antal olika alternativ som kan användas i enlighet med Forskningsintresset1. Här finns ett allmänt protokoll för humanisering av NS γ-kedjanNull möss och genetiskt liknande stammar som skall användas i tre olika modeller för att studera hiv-infektion. I den första experimentella metoden, bestrålade nyfödda möss injiceras med Human CD34+ hscs, som kan härled…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av IHV Clinical Division interna fonder till JCZ.
Materials
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
References
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
- Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
- Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
- Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
- Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
- Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
- Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
- Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
- Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
- Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
- Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), 1-16 (2019).
- Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID “Meet the Experts” 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
- Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, 150-154 (2013).
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of “humanized” mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , (2008).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, 67-78 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
- King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
- Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
- Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
- Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
- Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).
- Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , 15-24 (2015).
- Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
- Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
- Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
- Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
- Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, 155-159 (2013).
- Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
- Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
- Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
- Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
- Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).
