Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados
Summary
Aqui estão três abordagens experimentais para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV em camundongos humanizados. O primeiro permite o estudo de eventos de infecção crônica, enquanto os dois últimos permitem o estudo de eventos agudos após infecção primária ou reativação viral.
Abstract
Camundongosanulosos humanizados no nod/scid/il-2 receptor nulos recapitulam algumas características da imunidade humana, que podem ser exploradas em pesquisas básicas e pré-clínicas sobre doenças infecciosas. Aqui estão três modelos de camundongos imunodeficientes humanizados para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV. O primeiro é baseado na injeção intrahepática de CD34+ células-tronco hematopoiéticas em camundongos recém-nascidos, o que permite a reconstituição de várias células confinadas no sangue e tecido linfóide, seguida de infecção por uma cepa de HIV de referência. Este modelo permite o monitoramento por até 36 semanas após a infecção e, portanto, é chamado de modelo crônico. O segundo e o terceiro modelos são referidos como os modelos agudos e de reativação, nos quais as células mononucleares periféricas do sangue são injetadas intraperitoneally em camundongos adultos. No modelo agudo, as células de um doador saudável são enxertadas através da rota intraperitoneal, seguidas de infecção por uma cepa de HIV de referência. Finalmente, no modelo de reativação, as células de um doador infectado pelo HIV terapia antirretroviral são enxertadas através da rota intraperitoneal. Neste caso, um ambiente livre de drogas no mouse permite a reativação do vírus e um aumento na carga viral. Os protocolos aqui fornecidos descrevem a abordagem experimental convencional para modelos de camundongos humanizados e imunodeficientes da infecção pelo HIV.
Introduction
O modelo humanizado de camundongos nod/SCID/interleucina (IL)-2 receptor diminuidor (doravante referido como huNS γ-cadeianulo)modelo de camundongo tem sido amplamente utilizado para estudar a patogênese de infecções, autoimunidade e câncer, bem como para estudos pré-clínicos de drogas e terapias baseadas em células humanas1,2. Estes camundongos são baseados em um fundo diabético não obeso (NOD), com a mutação cidacada e mutação direcionada no locus il-2 receptor matador-cadeia (massa de turma comum de turma t-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), que induzem um grave prejuízo no desenvolvimento de células t-, b-e-assassino natural (NK) do ratoT-,B-e natural (NK) . Assim, eles suportam o enxerto de tecido humano, CD34 humano+ células-tronco hematopoiéticas (HSCs), e células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs)3,4,5. Além disso, a expressão transgênica de fatores hematopoiéticos humanos, como fator de células-tronco (SCF), fator estimulante da colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) e IL-3 promove o enxerto das populações mieloides humanas6,7,8.
Para estudos de HIV, vários modelos de camundongosnulos da cadeia de metodos huNS foram descritos, que diferem na cepa do camundongo, tipo de células humanas usadas, tipo de tecidos para o enxerto e origem das células (ou seja, saudável vs. Doador infectado pelo HIV)9,10. A cepa original, no entanto, é amplamente utilizada devido aos altos níveis de enxerto de células humanas e replicação viral após a infecção com uma referência da cepa HIV11,12,13. Cepas de camundongos imunodeficientes semelhantes com expressão transgênica de fatores hematopoiéticos humanos (por exemplo, RATOS NOG-EXL ou NSG-SGM3) ou com implantes de tecidos do fígado humano e do timo (camundongos de medula óssea-fígado-timo [BLT]) são úteis para avaliar o papel das populações mieloides na resposta imune anti-HIV, efeitos do HIV nesses tecidos e sua participação como reservatórios virais14,15. Além disso, algumas cepas com expressão transgênica de moléculas de antígeno leukócito humano (HLA), bem como camundongos BLT, podem ser usadas para estudar a resposta das células T à infecção pelo HIV16,17.
Em geral, nesses camundongos, a humanização depende da origem celular, da rota de entrega (intraperitoneal, intrahepática, intravenosa, intracardiac) e da idade do rato no momento do enxerto18,19,20. Em relação à origem celular, CD34+ HSC humano derivado de sangue do cordão umbilical, fígado fetal ou sangue periférico mobilizado pode ser injetado em camundongos recém-nascidos ou jovens3,21. Além disso, camundongosnulos adultos da cadeia de γ podem ser humanizados pela injeção de PBMC (aqui, referido como camundongosnulos da cadeia de metodolses de cadeia de metodolses hu-PBL-NS), permitindo a circulação temporal dessas células no sangue, órgãos linfoidos secundários e tecidos inflamados22,23,24.
Descrito aqui é um protocolo detalhado para o estabelecimento de modelos de camundongosnulos da cadeia de metodos huNS para o estudo da infecção pelo HIV. O primeiro é o modelo crônico, em que cd34 humanos+ HSCs derivados do sangue do cordão umbilical de um doador saudável são injetados em camundongos recém-nascidos, seguido de infecção com uma cepa de REFERÊNCIA HIV após 14 semanas de reconstituição do sistema imunológico humano. Este modelo permite a monitoração dos ratos por até ~36 semanas após a infecção. O segundo modelo é um modelo agudo, no qual pbmcs derivados de um doador saudável são injetados em adultos ns- cadeia de ratosnulos, seguido por infecção com uma referência da estirpe de HIV após 3 semanas de expansão de células T humanas no mouse. Finalmente, o terceiro modelo é o modelo de reativação, no qual os PBMCs derivados de um doador infectado pelo HIV terapia antirretroviral supressiva (TARV) são injetados em camundongosnulos adultos da cadeia de metodols. Neste caso, um ambiente livre de drogas permite a reativação viral e aumento da carga viral. Os dois últimos modelos permitem o monitoramento por até ~9 semanas após o enxerto.
No geral, esses três modelos são úteis para estudos virológicos, estudos pré-clínicos de novos medicamentos e avaliação dos efeitos da infecção pelo HIV na resposta imune global. Também é importante considerar que o uso de camundongos humanizados infectados pelo HIV requer revisão e aprovação pelo Comitê Institucional de Biossegurança (IBC), bem como pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) antes de qualquer experimento. Isso garante que o estudo siga todas as regulamentações institucionais internas e externas para o uso de material biológico perigoso e manuseio humano de animais experimentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avanços importantes foram alcançados no desenvolvimento de cepas de camundongos imunodeficientes para a humanização, com uma série de opções diferentes que podem ser usadas de acordo com o interesse da pesquisa1. Desde que aqui é um protocolo geral para a humanização de ratosnulos da cadeia de metodos e cepas geneticamente semelhantes a serem empregadas em três modelos diferentes para estudar a infecção pelo HIV. Na primeira abordagem experimental, camundongos recém-nascid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por fundos internos da divisão clínica do IHV para a JCZ.
Materials
| 0. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3735.S.X | |
| 1. 5 ml Microcentrifuge tubes | Neptune | 3745.S.X | |
| 10 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0010 | |
| 15 ml conical tubes | Stellar scientific | T15-600 | |
| 25 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0025 | |
| 5 ml Serologial pipetes | stellar sceintific | VL-4090-0005 | |
| 50 ml conical tubes | Stellar scientific | T50-600 | |
| ACK lysis buffer | Quality biological | 118-156-101 | |
| Alcohol prep pads | Fisher scientific | 06-669-62 | Sterile |
| Anti-Human CD3 clone UCHT1 | Biolegend | 300439 | APC conjugated |
| Anti-Human CD4 clone OKT4 | Biolegend | 317420 | AF488 conjugated |
| Anti-Human CD45 clone 2D1 | Biolegend | 368522 | BV421 conjugated |
| Anti-Human CD8 clone SK1 | Biolegend | 344710 | PerCP-Cy5.5 conjugated |
| Biosafaty cabinet level 2 | If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane | ||
| Bonnet | Fisher scientific | 17-100-900 | Single use cap for basic protection |
| Cavicide | Metrex | 13-1000 | Surface desinfectant |
| CD34+ cells | Lonza | 2C-101 | As many vials available from a single donor |
| Centrifuge | Beckman | 65-6KR | |
| Clear jar | Amazon | 77977 | |
| Cotton gauze pad | Fisher scientific | 22-415-468 | Sterile |
| Disposable lab coats | Fisher scientific | 19-472-422 | |
| EDTA micro tubes | Greiner bio-one | 450480 | |
| Face Mask | Fisher scientific | 17-100-897 | |
| FACS lysing solution | BD | 340202 | |
| FBS premium HI | Atlanta biologicals | S1115OH | |
| Ficoll | GE health one | 17-1440-02 | |
| Flow cytometer | We used FACS Aria II | ||
| Flow cytometry tubes | Falcon | 352054 | 5 ml polystyrene and round bottom |
| HIV BaL | Prepared in our uQUANT core facility | ||
| Human PBMCs | HIV positive and negative volunteers | ||
| Infrared warming pad | Venet scientific | DCT-25 | Temporary therapeutic warming pad for small animals |
| Isentress (Raltegravir) | Merck | NSC 0006-0227061 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor |
| Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Mark I irradiator | Equipment belonging to university of Maryland | ||
| Micro pipettes | |||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Mouse ear tags | National Band & Tag company | 1005-1L1 | |
| Natelson blood collection tubes | Fisher scientific | 02-668-10 | |
| NOG-EXL | Taconic | HSCFTL-13395-F | |
| NSG mice | Jackson | 5557 | Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment |
| NSG-SGM3 | Jackson | 13062 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron microscopy sciences | 15710 | |
| PBS 1X pH 7.4 | Gibco | 100-10-023 | |
| Petri dishes | Fisher scientific | 08-757-28 | |
| Quantistudio qPCR machine | Thermo | QS3 | |
| Reagent reservoirs | Costar | 4870 | |
| RPMI media 1640 1X | Gibco | 11875-093 | |
| Shoe covers | Fisher scientific | 17-100-911 | |
| Sterile disposable Gloves | Microflex | SUF-524 | |
| SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix | Invitrogen | 10080-400 | cDNA synthesis |
| Syringes 28-G x 1/2 | BD | 329-461 | |
| Syringes 29-G x 1/2 | BD | 324-702 | |
| Truvada (Emtricitabine and Tenofovir | Gilead | NDC 61958-0701-1 | Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | Cell count and viability |
| Vick Vaporub | School health | 43214 | Ointment based on menthol and eucalyptus |
| Water molecular biology grade | Quality biological | 351-029-131 |
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