שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים
Summary
מאמר זה מתאר שיטה לטעינת עוברי שברירי הדגים עבור מיקרוסקופ הזמן המורחבת הקפיצה הדקה. שיטה בעלות נמוכה זו קלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופית תחתית רגילות של זכוכית להדמיה בכל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים.
Abstract
הדינמיקה של פיתוח יכול להיות בעקבות מיקרוסקופ זמן הקפיצה של התהליך של העוברים חיים הטרנסגניים לחיות ביטוי של זריחה ברקמות או בתאים ספציפיים. קושי עם הדמיה של התפתחות העובר כולו הוא כי עוברי דגים לצמוח באופן משמעותי באורך. כאשר נטען באופן קבוע ב-0.3-1% ממיסים נמוך, מטילה הצמח מגבלות גידול, המובילות לעיוותים בגוף העובר הרך. ובכל זאת, כדי לבצע מיקרוסקופ לצניחה בזמן מיקוד, העובר חייב להיות ללא תנועה. מאמר זה מתאר שיטת הרכבה שכבתית עבור עוברי דגים המגבילים את תנועתיות העוברים ומאפשרת צמיחה בלתי מוגבלת. ההרכבה מבוצעת בשכבות של הצמח בריכוזים שונים. כדי להדגים את השימושיות של שיטה זו, כלי הדם של העובר כולו, התפתחות עצבית ושרירים הייתה התמונה בדגים טרנסגניים במשך 55 שעות רצופות. שיטה זו הרכבה ניתן להשתמש בקלות, בעלות נמוכה הדמיה של עוברי דג זברה שלמים באמצעות מיקרוסקופים הפוכה ללא דרישות של תבניות או ציוד מיוחד.
Introduction
הדג הגדול הינו אורגניזם מודל לביולוגיה התפתחותית, והמיקרוסקופיה היא השיטה העיקרית להמחיש את ההתפתחות העובלנית. יתרונות השימוש בעוברי דגים למחקרים התפתחותיים כוללים גודל קטן, בהירות אופטית, פיתוח מהיר ופוריות גבוהה של הדג המבוגר. הדור של הקווים הטרנסגניים המבטא זריחה ברקמות או תאים מסוימים אפשרו הדמיה ישירה של פיתוח רקמות בדרכים לא אפשרי עם בעלי חיים גדולים יותר בעלי חוליות. בשילוב עם מיקרוסקופ לשגות בזמן, פרטים ודינמיקה של פיתוח רקמות ניתן ללמוד בקלות.
קושי בהתפתחות הדמיה של דגי ההדמיה הוא שהעוברים גדלים באופן משמעותי באורך; העובר מרחיב את אורכו ארבע פעמים בתוך 3 הימים הראשונים של החיים1. גם, הגוף של העובר המוקדם הוא רך, ובקלות הופך להיות מעוות אם הצמיחה היא מוגבלת. ובכל זאת, כדי לבצע מיקרוסקופ ממוקד, העובר חייב להיות ללא תנועה. כדי לשמור על העוברים בעמדה קבועה עבור הדמיה זמן מיקוד התמונה, הם מורדם באופן קבוע ורכוב ב 0.3-1% נמוך להמיס. לדבר זה יש יתרון של התרת צמיחה מסוימת במהלך ההדמיה לתקופה מסויימת, תוך הגבלת תנועות העובר. חלקים של העובר יכול להיות ביעילות להיות בתמונה כך. עם זאת, בעת שימוש בשיטה זו עבור הדמיה של העובר כולו עבור פרקי זמן מורחבים, עיוותים הם נצפו בשל הצמיחה המוגבלת הנגרמת על ידי הצמח. לכן, נדרשות שיטות הרכבה אחרות. קאופמן ועמיתיו תיארו הרכבה חלופית של עוברי דג דג זברה עבור מיקרוסקופ גיליון אור, כגון מיקרוסקופ התאורה סלקטיבי המטוס (spim), על ידי הרכבה העוברים ב-fluorinated אתילן פרופילן (fep) צינורות המכילים ריכוזים נמוכים של agarose או מתילתאית2. טכניקה זו מייצרת ויזואליזציה מעולה של embryogenesis לאורך זמן. Schmid ואח ‘ לתאר הרכבה של עד שישה עוברים ב agarose בצינורות פבואר עבור מיקרוסקופ גיליון אור3 מתן ויזואליזציה של מספר עוברים במפגש אחד הדמיה. בתבניות נעשה שימוש כדי ליצור מערכי העובר להרכבה יעילה של מספר גדול יותר של עוברים4. מסקינקיות ואח ‘ בנויים בתבניות פלסטיק מודפס 3d שניתן להשתמש בהם כדי להפוך סיליקון מטיל כי העוברים בשלבים שונים ניתן להציב, המאפשר להרכבה בעמדה קבועה עבור הדמיה, כולל הדמיה קונפוקלית וקד5. הדפסה תלת-ממדית השתמשה גם כדי ליצור תבניות עבור מיקום עקבי של עוברי צבפיש 96-ובכן פורמט6. תבניות מסוימות מותאמות אישית עבור שלבים מסוימים ולא ניתן להתיר צמיחה בלתי מוגבלת לפרקי זמן ארוכים, בעוד שתבניות אחרות גמישות יותר. לאחרונה, Weijts ואח ‘ פרסמה את העיצוב והייצור של מאכל ארבע היטב עבור הדמיה חיה של עוברי דגיםשבעה 7. בתבשיל זה, הזנב והגזע של עוברי דגים מורדם ממוקמים באופן ידני תחת גג סיליקון ברור מחובר ממש מעל זכוכית כיסוי כדי ליצור כיס. העובר הוא תוקן לאחר מכן במיקום זה על ידי תוספת של 0.4% agarose. הרכבה זו מאפשרת הדמיה של החלק האחורי של כ 2 מ”מ (העורק והזנב) של העובר, וכמו עד 12 עוברים ניתן לרכוב לכל טוב, השיטה מאפשרת הדמיה של דגימות מרובות. באופן דומה, הירסינגר ו סטבנטון הציגו לאחרונה שיטה שבה ראש הדג מותקן בתוך agarose, בעוד הזנב יכול לצמוח בחופשיות, ושיטה זו גם מקלה ביעילות הדמיה של הגזע והזנב של העובר8.
מאמר זה מתאר שיטת הרכבה שכבתית עבור עוברי דגים המגבילים את תנועות העוברים תוך התרת צמיחה בלתי מוגבלת. היתרונות של שיטה זו הרכבה הם כי היא בעלות נמוכה, שיטה מהירה וקל לעלות על העוברים של שלבים שונים עבור הדמיה באמצעות כל מיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מאפשרת הדמיה ארוכת טווח של הגוף כולו (ראש, גזע וזנב) במהלך התפתחות העובר. כדי להציג את השימושיות של שיטה זו, כלי הדם של העובר כולו, התפתחות עצבית ושרירים הייתה מתמונה בדגים טרנסגניים. שני עוברים בכל הפעלה, בשני אורכי גל תלת-ממד הוצגו על ידי מיקרוסקופ הזמן לשגות עבור 55 שעות רצופות כדי להפוך סרטים של פיתוח רקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת הרכבה עבור מיקרוסקופיה מורחבת של מיקרוסקופית הזמן של עוברי הדגים השלם מתוארת כאן. הצעד הקריטי ביותר עבור שיטת ההרכבה היא לזהות את הריכוז האופטימלי של agarose כי יאפשר צמיחה בלתי מוגבלת של העובר, ובאותו זמן לשמור על העוברים בעמדה קבועה לחלוטין עבור הדמיה קונפוקלית וקד. מכיוון שהריכוז האו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאלברט פן ולארגו סיאיקמן על מתנות של דגי הטרנסגניים. אנו מודים לקואיצ’י קסטאמי במכון הלאומי לגנטיקה, פרויקט BioResource הלאומי ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה של יפן עבור מתנת הHGn39bהטרנסגניים. כמו כן, אנו מודים לפטימה מרצ ולקתלין גאייבסקי לסיוע במיקרוסקופיה וטרייסי ת’ייולט לתצלומים.
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים מן המכון הלאומי למדעי הסביבה של המוסדות הלאומיים לבריאות (גרנט מספר P30ES023512 וחוזה מספר HHSN273201500010C). SU נתמך על ידי מחבר מהתוכנית Keck בביולוגיה סרטן התוכנית (מפרץ החוף קונסורציומים CPRIT גרנט RP140113) ועל ידי רועי הקרן הקרנות. J-Å G נתמכת על ידי הקרן רוברט א. וולש (E-0004).
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
