Injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas
Summary
La reconstrucción esofágica es un procedimiento desafiante, y el desarrollo de un esófago diseñado con tejido que permite la regeneración de la mucosa esofágica y el músculo y que se puede implantar como un injerto artificial es necesario. Aquí, presentamos nuestro protocolo para generar un esófago artificial, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores y diversas técnicas quirúrgicas.
Abstract
El uso de materiales biocompatibles para la reconstrucción esofágica circunferencial es una tarea técnicamente difícil en ratas y requiere una técnica de implante óptima con apoyo nutricional. Recientemente, ha habido muchos intentos de ingeniería de tejido esofágico, pero la tasa de éxito ha sido limitada debido a la dificultad en la epitelización temprana en el entorno especial de la peristalsis. Aquí, desarrollamos un esófago artificial que puede mejorar la regeneración de la mucosa esofágica y las capas musculares a través de un andamio tubular de dos capas, un sistema de biorreactor a base de células madre mesenquimales, y una técnica de alimentación de bypass con Gastrostomy. El andamio está hecho de nanofibras de poliuretano (PU) en forma cilíndrica con una hebra de policaprolactona impresa tridimensional (3D) envuelta alrededor de la pared exterior. Antes del trasplante, las células madre mesenquimales derivadas del ser humano se sembraban en el lumen del andamio, y se realizaba el cultivo del biorreactor para mejorar la reactividad celular. Mejoramos la tasa de supervivencia del injerto aplicando anastomosis quirúrgica y cubriendo la prótesis implantada con un colgajo de la glándula tiroides, seguido de la alimentación temporal de la gastrostomía no oral. Estos injertos fueron capaces de recapitular los hallazgos de epitelización inicial y regeneración muscular alrededor de los sitios implantados, como lo demuestra el análisis histológico. Además, se observaron un aumento de las fibras de elastina y la neovascularización en la periferia del injerto. Por lo tanto, este modelo presenta una nueva técnica potencial para la reconstrucción esofágica circunferencial.
Introduction
El tratamiento de los trastornos esofágicos, como las malformaciones congénitas y los carcinomas esofágicos, puede conducir a la pérdida del segmento estructural del esófago. En la mayoría de los casos, se han realizado injertos de reemplazo autólogos, como conductos de extracción gástricos o interposiciones de colon,1,2. Sin embargo, estos reemplazos esofágistas tienen una variedad de complicaciones quirúrgicas y riesgos de reoperación3. Por lo tanto, el uso de andamios de esófago con ingeniería de tejido imitando el esófago nativo puede ser una estrategia alternativa prometedora para regenerar finalmente los tejidos perdidos4,5,6.
Aunque un esófago con ingeniería de tejido potencialmente ofrece una alternativa a los tratamientos actuales de defectos esofágicos, existen barreras significativas para su aplicación in vivo. La fuga anastomótica postoperatoria y la necrosis del andamio esofágico implantado conducen inevitablemente a una infección letal del espacio aséptico circundante, como el mediastinum7. Por lo tanto, es extremadamente importante prevenir la contaminación de alimentos o saliva en la herida y el tubo nasogástrico. Se debe considerar la gastrostomía o la nutrición intravenosa hasta que se complete la cicatrización de la herida primaria. Hasta la fecha, la ingeniería de tejido esofágico se ha realizado en grandes modelos animales porque los animales grandes sólo pueden ser alimentados por hiperalimentación intravenosa durante 2-4 semanas después de la implantación del andamio8. Sin embargo, no se ha establecido tal modelo de alimentación no oral para la supervivencia temprana después del trasplante de esófago en animales pequeños. Esto se debe a que los animales eran extremadamente activos e incontrolables, por lo que no podían mantener el tubo de alimentación en sus estómagos durante un largo período de tiempo. Por esta razón, ha habido pocos casos de trasplante de esófago exitoso en animales pequeños.
En vista de las circunstancias de la ingeniería del tejido esofágico, diseñamos un andamio tubular de dos capas que consiste en nanofibras electrospun (capa interna; Figura 1A) y una hebra impresa en 3D (capa exterior; Figura 1B) incluyendo una técnica de gastrostomía modificada. La nanofibra interna está hecha de PU, un polímero no degradable, y evita la fuga de alimentos y saliva. Las hebras externas impresas en 3D están hechas de policaprolactona biodegradable (PCL), que puede proporcionar flexibilidad mecánica y adaptarse al movimiento peristáltico. Las células madre mesenquimales derivadas de los adiposos humanos (hAD-MSC) fueron sembradas en la capa interna del andamio para promover la reepitelización. La estructura de nanofibra puede facilitar la regeneración inicial de la mucosa proporcionando un entorno de matriz extracelular estructural (ECM) para la migración celular.
También hemos aumentado la tasa de supervivencia y la bioactividad de las células inoculadas a través del cultivo del biorreactor. El andamio implantado estaba cubierto con un colgajo de la glándula tiroides para permitir una regeneración más estable de la mucosa esofágica y la capa muscular. En este informe, describimos protocolos para técnicas de ingeniería de tejido esofágico, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores a base de células madre mesenquimales, una técnica de alimentación de bypass con gastrostomía modificada y una técnica de anastomosis para la reconstrucción esofágica circunferencial en un modelo de rata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los estudios en animales existentes sobre esofagia artificial siguen estando limitados por varios factores críticos. El andamio esofágico artificial ideal debe ser biocompatible y tener excelentes propiedades físicas. Debe ser capaz de regenerar el epitelio de la mucosa en el período postoperatorio temprano para evitar fugas anastomóticas. La regeneración de las capas musculares longitudinales circulares y externas internas también es importante para la peristalsis funcional12,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Proyecto de I+D de La Tecnología Sanitaria de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria Sanitaria de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (número de concesión: HI16C0362) y el Instituto de Investigación en Ciencias Básicas Programa a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2017R1C1B2011132). Los bioespecímenes y los datos utilizados en este estudio fueron proporcionados por el Biobanco del Hospital Universitario Nacional de Seúl, miembro de Korea Biobank Network.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
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