Purkinje-cellernes overlevelse i Udsnitskulturer af Organotypiske cerebellar
Summary
Organotypiske skive kulturer er et kraftfuldt værktøj til at studere neuroudviklingsmæssige eller degenerative/regenerative processer. Her beskriver vi en protokol, der modeller den neuroudviklingsmæssige død af Purkinje celler i mus cerebellar skive kulturer. Denne metode kan gavne forskning i neuroprotektive Drug Discovery.
Abstract
Organotypiske skive kultur er en kraftfuld in vitro-model, der efterligner in vivo betingelser tættere end dissocierede primære cellekulturer. I den tidlige postnatal udvikling, cerebellar Purkinje celler er kendt for at gå gennem en sårbar periode, hvor de gennemgår programmeret celledød. Her giver vi en detaljeret protokol til at udføre mus organotypic cerebellar skive kultur i denne kritiske tid. Udsnittene er yderligere mærket for at vurdere Purkinje-cellens overlevelse og effekten af neuroprotektive behandlinger. Denne metode kan være yderst værdifuld at screene for nye Neuro aktive molekyler.
Introduction
In vitro modellering er et vigtigt redskab i biomedicinsk forskning. Det giver forskerne mulighed for at studere og stramt kontrollere specifikke mekanismer i begrænset celletyper, eller i isolerede systemer/organer. Organotypiske skive kultur er en meget anvendt in vitro-teknik, især inden for neurovidenskab1. Metoden blev først etableret af Gähwiler, der dyrkede hjerne skiver ved hjælp af valse røret Technique2, og senere modificeret af Yamamoto et al., der introducerede brugen af en Mikroporøs membran til at udføre kortikale skive kulturer3. Sammenlignet med primære cellekulturer, organotypiske skive kulturer præsentere fordelen ved at bevare den cytoarkitektur af vævet, samt indfødte celle-celleforbindelser i flyet af vævs sektionen.
Organotypiske skiver er blevet dyrket fra mange dele af det centrale nervesystem, såsom hippocampus4, cortex5, striatum6, cerebellum4,7, og rygmarven8,9, blandt andre. De har vist sig at være et kraftfuldt værktøj i Drug Discovery undersøgelser10. Virkningerne af Neuro aktive molekyler kan vurderes på mange måder: overlevelse og neurodegeneration ved hjælp af immun farvning og biokemiske analyser, neuronal kredsløb dannelse, eller afbrydelse ved hjælp af Elektrofysiologi og Live-imaging.
Målet med dette arbejde er at beskrive en simpel metode til at udføre organotypiske cerebellar skive kultur, som er kendt for at være en relevant model til at efterligne cerebellare udvikling in vitro. Især fokuserede vi på studiet af Purkinje Cell udviklingsmæssige død. In vivo gennemgår Purkinje celler apoptose i løbet af den første postnatale uge og toppede på postnatale dag 3 (P3)11. Det samme mønster er observeret i cerebellare skive kultur, med Purkinje neuroner dør af apoptose, når cerebella er taget fra dyr mellem P1 og P8, med et højdepunkt på P34,12. Brugen af den organotypiske cerebellare skive kulturer har gjort det muligt at identificere flere neuroprotektive molekyler7,13, samt forståelse en del af de mekanismer, der er involveret i denne programmerede celledød14,15,16. Her beskriver vi en protokol baseret på studiet af Stoppini et al.17 i hippocampus og tilpasset cerebellum af Dusart et al.4 det omfatter hurtig dissektion og hakning af postnatal cerebella; udskæring af kulturen på en cellekultur indsats, der indeholder en Mikroporøs membran, med eller uden neuroprotektive behandling; og immunofluorescens farvning for at vurdere neuronal overlevelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebellar skive kultur er et kraftfuldt værktøj til at studere programmeret Purkinje celledød under postnatal udvikling. Denne teknik kan bruges til hurtigt at screene kandidat molekyler for deres neuroprotektive potentiale. Den største fordel er, at opsætningen er enkel og meget omkostningseffektiv, og kræver kun en beskeden investering i udstyr (en vibratome kan koste op til 3 gange mere end en vævs chopper). Desuden kan 10 til 15 sunde skiver genereres fra en mus pup, giver mulighed for forskellige analyser, d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Imaging arbejde blev udført på Northwestern University Center for Advanced Microscopy generøst støttet af NCI CCSG P30 CA060553 tildelt Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Vi takker Sean McDermott for hans tekniske assistance og støtte, og Maya Epstein for de håndtegnede illustrationer, der er vist i figur 1.
Materials
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Mouse IgG secondary antibody | ThermoFisher scientific | A21203 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | ThermoFisher scientific | 21010046 | |
| Biosafety cabinet Class II, Type A2 | NuAire | NU-540-400 | |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | |
| Brush | |||
| anti-Calbindin D-28K antibody (CB-955) | Abcam | ab82812 | |
| CO2 Incubator | NuAire | NU-5700 | |
| Corning Costar Flat Bottom 6-well Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Coverslips, 22 x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Dressing forceps, straight | Harvard Apparatus | 72-8949 | |
| Double edge blades | Fisher Scientific | 50949411 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Labs, Inc | 2701 | |
| Eye Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8428 | |
| Fine forceps | Fisher Scientific | 16-100-127 | |
| L-Glutamine 100X | ThermoFisher scientific | 25030149 | |
| Glucose solution | ThermoFisher scientific | A2494001 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | ThermoFisher scientific | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Fisher Scientific | H21492 | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | ThermoFisher scientific | 26050088 | |
| ImageJ | |||
| McIlwain Tissue Chopper | Fisher Scientific | NC9914528 | |
| Microprobes | Fisher Scientific | 08-850 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore Sigma | PICM0RG50 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane, 250 mL | ThermoFisher scientific | 168-0045 | |
| Nikon A1R confocal laser microscope system | Nikon | ||
| NIS-Elements Imaging Software | Nikon | ||
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 41678-0010 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher scientific | P10144 | |
| Operating Scissors, straight | Harvard Apparatus | 72-8403 | |
| Orbital shaker Belly Dancer | IBI Scientific | BDRLS0003 | |
| Prism 8 | GraphPad | ||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Culture Dish, 60 mm w/ grip ring | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Tissue culture plate, 24 well | Falcon/Corning | 353047 | |
| Transfer pipettes, sterile | ThermoFisher scientific | 13-711-21 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher scientific | BP151-500 |
References
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study. Journal of Neuroscience. 17 (10), 3710-3726 (1997).
- Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (125), e55886 (2017).
- Daviaud, N., et al. Modeling nigrostriatal degeneration in organotypic cultures, a new ex vivo model of Parkinson’s disease. Neuroscience. 256, 10-22 (2014).
- Ghoumari, A. M., et al. Mifepristone (RU486) protects Purkinje cells from cell death in organotypic slice cultures of postnatal rat and mouse cerebellum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7953-7958 (2003).
- Labombarda, F., et al. Neuroprotection by steroids after neurotrauma in organotypic spinal cord cultures: a key role for progesterone receptors and steroidal modulators of GABA(A) receptors. Neuropharmacology. 71, 46-55 (2013).
- Gao, P., et al. P2X7 receptor-sensitivity of astrocytes and neurons in the substantia gelatinosa of organotypic spinal cord slices of the mouse depends on the length of the culture period. Neuroscience. , 195-207 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Jankowski, J., Miething, A., Schilling, K., Baader, S. L. Physiological purkinje cell death is spatiotemporally organized in the developing mouse cerebellum. Cerebellum. 8 (3), 277-290 (2009).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., Bernard, O., Sotelo, C., Dusart, I. Implication of Bcl-2 and Caspase-3 in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture: an in vitro model to study apoptosis. European Journal of Neuroscience. 12 (8), 2935-2949 (2000).
- Ghoumari, A. M., Wehrle, R., De Zeeuw, C. I., Sotelo, C., Dusart, I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration. Journal of Neuroscience. 22 (9), 3531-3542 (2002).
- Ghoumari, A. M., et al. Neuroprotective effect of mifepristone involves neuron depolarization. FASEB Journal. 20 (9), 1377-1386 (2006).
- Repici, M., Wehrle, R., Antoniou, X., Borsello, T., Dusart, I. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 play different roles in age-related Purkinje cell death in murine organotypic culture. Cerebellum. 10 (2), 281-290 (2011).
- Rakotomamonjy, J., Ghoumari, A. M. Brain-Derived Neurotrophic Factor Is Required for the Neuroprotective Effect of Mifepristone on Immature Purkinje Cells in Cerebellar Slice Culture. International Journal of Molecular Sciences. 20 (2), (2019).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Uesaka, N., et al. Organotypic coculture preparation for the study of developmental synapse elimination in mammalian brain. Journal of Neuroscience. 32 (34), 11657-11670 (2012).
- Falsig, J., et al. Prion pathogenesis is faithfully reproduced in cerebellar organotypic slice cultures. PLoS Pathogens. 8 (11), 1002985 (2012).
- Bouslama-Oueghlani, L., Wehrle, R., Sotelo, C., Dusart, I. The developmental loss of the ability of Purkinje cells to regenerate their axons occurs in the absence of myelin: an in vitro model to prevent myelination. Journal of Neuroscience. 23 (23), 8318-8329 (2003).
- Apuschkin, M., Ougaard, M., Rekling, J. C. Spontaneous calcium waves in granule cells in cerebellar slice cultures. Neuroscience Letters. 553, 78-83 (2013).
- Audinat, E., Knopfel, T., Gahwiler, B. H. Responses to excitatory amino acids of Purkinje cells’ and neurones of the deep nuclei in cerebellar slice cultures. Journal of Physiology. 430, 297-313 (1990).
