आयरन-सीमित माइकोबैक्टीरिया द्वारा उत्पादित एक्स्ट्रासेल्यूलर वेसिकल्स का अलगाव और विशेषता
Summary
माइकोबैक्टीरियम तपेदिक कम लोहे की स्थिति के जवाब में अतिरिक्त कोशिकीय vesicles के उत्पादन और रिहाई में वृद्धि से पता चलता है। यह काम कम लोहे की स्थिति और शोधन और लोहे की कमी के जवाब में जारी mycobactrial extracellular vesicles के लक्षण के लिए तरीकों के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण.
Abstract
माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी), मानव तपेदिक के कारक एजेंट सहित माइकोबैक्टीरिया, स्वाभाविक रूप से प्रतिरक्षा त्मक रूप से सक्रिय अणुओं वाले एक्स्ट्रासेल्यूलर वेसिकल (ईवीएस) को रिलीज करता है। vesicle जीवजनन के आणविक तंत्र के बारे में ज्ञान, vesicles की सामग्री, और रोगज़नक़-होस्ट इंटरफ़ेस पर उनके कार्य बहुत सीमित है। इन सवालों को संबोधित अलगाव, शुद्धि, और EVs के सत्यापन के लिए कठोर प्रक्रियाओं की आवश्यकता है. इससे पहले, vesicle उत्पादन बढ़ाया जा करने के लिए पाया गया था जब एम तपेदिक लोहे के प्रतिबंध के संपर्क में था, मेजबान वातावरण में Mtb द्वारा सामना करना पड़ा एक शर्त. यहाँ प्रस्तुत एक पूर्ण और विस्तृत प्रोटोकॉल को अलग करने और लोहे की कमी माइकोबैक्टीरिया से EVs शुद्ध है. मात्रात्मक और गुणात्मक तरीके शुद्ध EVs को मान्य करने के लिए लागू कर रहे हैं.
Introduction
माइकोबैक्टीरियल एक्स्ट्रासेलुलर vesicles (MEVs) झिल्ली से बंधे नैनोकणों, आकार में 60 डिग्री 300 एनएम, स्वाभाविक रूप से तेजी से और धीमी गति से बढ़ रही माइकोबैक्टीरिया1द्वारा जारी कर रहे हैं। रोगजनक माइकोबैक्टीरिया द्वारा जारी किए गए एमईवी एक तंत्र का गठन करते हैं जो इम्यूनोलॉजिकल रूप से सक्रिय प्रोटीन , लिपिड और ग्लाइकोलिपिड के माध्यम से मेजबान के साथ बातचीत करता है , जो एक केंद्रित और संरक्षित तरीके सेस्रावितहोता है 2,3,4. MEVs की विशेषता और उनके जीवजनन और कार्यों को समझने के लिए, vesicle शुद्धि और सत्यापन के सख्त और कुशल तरीके महत्वपूर्ण हैं. अब तक एमईवी को लौह समृद्ध माध्यम1,5,6,7,8में उगाए गए माइकोबैक्टीरिया की संस्कृति से अलग कर दिया गया है ।
हालांकि, पिछले काम का प्रदर्शन किया है कि लोहे की सीमा बहुत Mtb में vesicle रिहाई को उत्तेजित करता है, संभवतः mycobactin के माध्यम से लोहे पर कब्जा करने के लिए, एक siderophore MEVs9में स्रावित . हालांकि उच्च लौह माध्यम में संरक्षित Mtb से MEVs अलगाव के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है, कम लौह संस्कृतियों से MEVs प्राप्त करने के लिए एक कुशल पद्धति की सूचना नहीं दी गई है. इसलिए, इस विधि का लक्ष्य कम लौह संस्कृतियों से प्राप्त MEVs को अलग, शुद्ध, और परिमाणित करना है ताकि उनका उपयोग जैव रासायनिक और कार्यात्मक परख के लिए और माइकोबैक्टीरिया में vesicle उत्पादन के आनुवंशिक निर्धारकों के विश्लेषण के लिए किया जा सके।
Protocol
Representative Results
Discussion
यूकैरियोटिक कोशिका व्युत्पन्न एक्सोसोम को शुद्ध करने के लिए अनेक विधियों काविकास कियागया है। इसके विपरीत, बैक्टीरिया व्युत्पन्न EVs7को शुद्ध करने के लिए प्रभावी तरीकों पर सीमित जान?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण करने के लिए एंटी-एमईवी एंटीसेरा और नवनीत डोगरा को साझा करने के लिए हम राफेल Prados-Rosales के आभारी हैं।
Materials
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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