Isolering og karakterisering af patient-afledte bugspytkirtel ductal adenokarcinom Organoid modeller

Summary

Patient-afledte organoid kulturer af pancreas duktalt adenokarcinom er en hurtigt etableret 3-dimensionel model, der repræsenterer epiteliale tumor celle rum med høj pålidelighed, muliggør Translationel forskning i denne dødbringende malignitet. Her giver vi detaljerede metoder til at etablere og udbrede organoider samt til at udføre relevante biologiske assays ved hjælp af disse modeller.

Abstract

Pancreatisk duktalt adenocarcinom (pdac) er blandt de mest dødbringende maligniteter. For nylig, næste generations organoid kultur metoder muliggør den 3-dimensionelle (3D) modellering af denne sygdom er blevet beskrevet. Patient afledte organoid-modeller (Bob) kan isoleres fra både kirurgiske prøver og små biopsier og dannes hurtigt i kulturen. Det er vigtigt, at organoid-modellerne bevarer de patogene genetiske ændringer, der påvises i patientens tumor, og er prædiktiv for patientens behandlingsrespons, hvilket muliggør translationelle undersøgelser. Her giver vi omfattende protokoller til tilpasning af vævskultur workflow for at studere 3D, matrix indlejret, organoid-modeller. Vi detaljeret metoder og overvejelser for isolering og formeringsmateriale primære PDAC organoider. Desuden beskriver vi, hvordan specialfremstillede organoid-medier forberedes og kvalitetskontrolleres i laboratoriet. Endelig beskriver vi assays for downstream karakterisering af organoide modeller såsom isolering af nukleinsyre (DNA og RNA), og Drug test. Vigtigst af alt giver vi kritiske overvejelser for at implementere organoid metodologi i et forskningslaboratorium.

Introduction

Pancreas duktalt adenocarcinom (pdac) er en dødelig sygdom karakteriseret ved sen diagnose hos de fleste patienter, en mangel på effektive terapier, og en resulterende lav 5-årige samlede overlevelse, der forbliver mindre end 10%¹. Kun 20% af patienterne diagnosticeres med en lokaliseret sygdom, der egner sig til helbredende kirurgisk indgreb^2,3. De resterende patienter behandles typisk med en kombination af kemoterapeutika, der er effektive hos et mindretal af patienter^4,5. For at imødegå disse presserende kliniske behov arbejder forskerne aktivt på tidlige detekterings strategier og udvikling af mere effektive terapier. For at fremskynde klinisk oversættelse af vigtige opdagelser, er forskerne beskæftiger genmanipulerede musemodeller, patient afledte xenografts, enkeltlags celler linjer, og senest, organoid modeller⁶.

Tredimensionel epitelial organoid kultur ved hjælp af vækstfaktor og WNT-ligand rige betingelser for at stimulere spredningen af ikke-transformerede stamceller blev først beskrevet for musens tarm⁷ og blev hurtigt tilpasset til det normale humane pancreasvæv⁸. Ud over normal duktalt væv, organoid metodologi giver mulighed for isolation, ekspansion, og undersøgelse af humane pdac⁸. Vigtigere, metoden understøtter etableringen af organoider fra kirurgiske prøver, samt fine og centrale nåle biopsier, så forskerne kan studere alle stadier af sygdommen^9,10. Interessant, patient-afledte organoider rekapitulere velbeskrevne tumor transkriptomic undertyper og kan muliggøre udvikling af præcisionsmedicin platforme^9,11.

Nuværende organoid protokoller for PDAC muliggøre en vellykket udvidelse af mere end 70% af patientprøver fra kemo-naive patienter⁹. Her præsenterer vi de standardmetoder, som vores laboratorium har anvendt til at isolere, udvide og karakterisere patient afledte PDAC-organoider. Andre pdac organoid metoder er blevet beskrevet^12,13 men ingen sammenligning af disse metode er blevet grundigt udført. Da denne teknologi er relativt ny og skrider hurtigt frem, forventer vi, at disse protokoller vil fortsætte med at udvikle sig og forbedre; men principperne for vævs håndtering og organoid kultur vil fortsat være nyttige.

Protocol

Al indsamling af humane væv til forskningsbrug blev gennemgået og godkendt af vores interne revisions nævn (IRB). Alle følgende protokoller udføres under aseptiske forhold i et miljø med vævskultur i pattedyr. 1. forberedelse af medierne Konditioneret medie forberedelse.Bemærk: den menneskelige bugspytkirtel organoid medier kræver rigelige vækstfaktorer og næringsstoffer samt konditioneret medier tilskud til at give tilstrækkelig vækststimulation for organoid ekspans…

Representative Results

For at illustrere de udfordringer, der er forbundet med isolerende organoider fra PDAC, viser vi etableringen af en patient afledt organoid-kultur fra en lille hypocellulær tumorprøve. Efter indledende plating var kun få organiske oider synlige pr. brønd, som vist i figur 1. Organoider fik lov til at vokse sig større i løbet af 2 uge og blev urerne i henhold til vores protokol til at etablere en mere robust kultur, som vist i den tidlige og sene passage 1 repræsentative billeder (<str…

Discussion

Her præsenterer vi de nuværende protokoller for isolering, udvidelse og karakterisering af patient afledte PDAC organoider. Vores nuværende succesrate for at etablere organoid kultur er over 70%; Derfor er disse metoder endnu ikke blevet perfektioneret og forventes at forbedre og udvikle sig over tid. Der bør tages vigtige hensyn til stikprøvestørrelse, da PDAC har en lav neoplastisk cellularitet. Derfor vil små prøver indeholde få tumorceller, og vil kun generere en håndfuld organoider. Derudover får mange pa…

Materials

12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips
12 well plates	Olympus	25-106
15 ml LoBind conical tubes	Eppendorf	EP0030122208
15 ml tube Rotator and/or nutator
37 °C CO2 incubator
37 °C water bath
384 well plates	Corning	4588	Ultra low attachment, black and optically clear
A 83-01	TOCRIS	2939
ADV DMEM	ThermoFisher	12634010
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Automated cell counter
B27 supplement	ThermoFisher	17504044
Cell Recovery Solution	Corning	354253	Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C
CellTiterGlow	Promega	G7570	Luminescence cell viability reagent
Chloroform	Sigma	C2432
Computer
CryoStor CS10	StemCELL Tech	07930	Cell Freezing Solution
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells	Trevigen	3710-001-K
DMEM	ATCC	30-2002
DNase I	Sigma	D5025
Drug printer	Tecan	D300e	This is the drug printer we use in our laboratory
Excel			For data analysis
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11150-10
FBS	ThermoFisher	16000044
G-418	ThermoFisher	10131035
Gastrin I (human)	TOCRIS	3006
Gentle Collagenase/hyaluronidase	STEMCELL Tech	7919
GlutaMAX	ThermoFisher	35050061	Glutamine solution
GraphPad Prism			For data analysis
HEPES	ThermoFisher	15140122
Laminar flow tissue culture hood
Luminometer
L-Wnt-3A expressing cells	ATCC	CRL-2647
MACS Tissue Storage Solution	Miltenyi biotec	130-100-008
Matrigel Matrix	Corning	356230	Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced
Mr. Frosty Freezing Container	ThermoFisher	5100-0001
N-Acetylcysteine	Sigma	A9165
Nicotinamide	Sigma	N0636
p1000 pipette with tips
p200 pipette with tips
PBS	ThermoFisher	10010049
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher	15630080
primocin	InvivoGen	ant-pm-2
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm)	ThermoFisher	121-0020
Recombinant Human FGF-10	Peprotech	100-26
Recombinant Murine Noggin	Peprotech	250-38
Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade	VWR	89176-380
Tissue culture centrifuge
Tissue Culture Dishes 10 cm	Olympus	25-202
TRIZol	ThermoFisher	15596018	Acid Phenol solution
TrypLE Express	ThermoFisher	12605010
Y-27632	Sigma	Y0503
Zeocin	ThermoFisher	R25001