JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

생물학적 응용 을 위한 근적외선 방출 금 나노클러스터의 합성

Published: March 22, 2020
doi:
10.3791/60388
, , , , , ,
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics,Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science,Charles University, 4First Faculty of Medicine,Charles University

Summary

유세포 분석 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경검사법에 의한 기능적, 근적외선 발광 광발광 금 나노클러스터 및 HeLa 세포 내부의 직접 검출을 위한 신뢰할 수 있고 쉽게 재현 가능한 방법이 설명되어 있습니다.

Abstract

지난 10년 동안 형광금 나노클러스터(AuNCs)는 생물학적 응용 분야에서 인기가 높아지고 있으며 개발에 많은 노력을 기울였습니다. 이 프로토콜에서는 수용성, 생체 적합성 및 콜로이드적으로 안정된 근적외선 방출 AuNCs의 제조를 위한 최근에 개발된, 허구 적인 방법이 상세히 기술되었다. 이 실온, 상향식 화학 합성은 수성 용액에 티옥산 및 티올 변형 폴리에틸렌 글리콜로 덮인 쉽게 기능성 AuNCs를 제공합니다. 합성 접근법은 유기 용매 나 추가 리간드 교환이나 합성 화학에 대한 광범위한 지식을 필요로하지 않습니다. 생성된 AuNCs는 무료 표면 카르복실산을 제공하며, 이는 AuNCs의 광발광 특성에 악영향을 미치지 않으면서 자유 아민 그룹을 베어링하는 다양한 생물학적 분자로 기능화될 수 있습니다. HeLa 세포에 의한 AuNC 섭취량의 유세포측정 정량화 및 공초점 현미경 이미징을 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 절차도 기술되었다. 큰 스토크스 시프트로 인해 AuNCs의 근적외선 광발광을 효율적으로 검출하려면 유세포 분석 및 공초점 현미경 검사법에서 필터를 적절히 설정해야 합니다.

Introduction

지난 10 년 동안, 초소형 (≤ 2 nm) 광 발광 금 나노 클러스터 (PL AuNCs)는 기초 연구 및 실용적인 응용 프로그램 모두 유망한 프로브로 등장했다1,,2,,3,,4,,5,,6,,7,,8,99,10.8 그들의 많은 바람직한 특성은 높은 광 안정성, 조정 가능한 방출 최대, 긴 방출 수명, 큰 스토크스 교대, 낮은 독성, 좋은 생체 적합성, 신장 클리어런스 및 허구 생체 융합을 포함한다. PL AuNCs는클러스터(11) 내의 원자수 및 표면리간드(12)의성질에 따라 청색에서 근적외선(NIR) 스펙트럼 영역으로 광발광을 제공할 수 있다. NIR (650-900 nm) 방출 AuNCs는 특히 내재 자가 형광, 약한 산란 및 흡수 및 NIR 빛의 높은 조직 침투와 최소 중첩으로 인해 높은 신호 대 잡음 비를 제공하기 때문에 세포 및 조직의 장기 생체 외 및 생체 내 이미징에 특히 유망하다13,,14.

최근에는, Au-S 공유 상호작용을 활용하는 다양한 접근법이 개발되어 NIR-PL AuNCs가 다양한 티올 함유 리간드13,,15,,16,,17로덮여 있다. 생체 의학 응용의 경우, AuNCs는 결합 상호 작용을 용이하게하기 위해 생물학적 구성 요소로 기능화되어야합니다. 따라서, 수성 용매에서 쉽게 기능화할 수 있는 높은 콜로이드 안정성을 가진 AuNCs는 매우 바람직하다. 현재 프로토콜의 전반적인 목표는 수성 환경에서 티옥산 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 구체적으로 적용하고 산-아민 커플링 방법에 따른 1차 아민을 가진 분자와의 활용을 통해 표면에 기능성 카르복실산 그룹을 가진 AuNCs의18가지 제제를 상세히 설명하는 것이다. 합성의 용이성과 높은 재현성 때문에, 이 프로토콜은 비화학 배경의 연구자들이 사용하고 적응할 수 있습니다.

생물 의학 연구에서 AuNCs의 응용을 위한 주요 필수 조건 중 하나는 세포 내부의 AuNCs를 관찰하고 측정하는 능력입니다. 세포에 의한 나노입자 섭취를 모니터링할 수 있는 방법 중, 유세포 분석법(FCM) 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 많은 수의세포에서형광 나노물질의 내재화를 빠르게 측정할 수 있는 강력하고 높은 처리량 방법을 제공한다. 여기서, 추가염료없이 세포 내부의 PL AuNCs의 직접 측정 및 분석을 위한 FCM 및 CLSM 방법도 제시되었다.

Protocol

1. 근적외선 방출 AuNCs 의 준비 (1) 7.8 mg (37.8 μmol) 티옥산 (TA) 및 2 M NaOH의 60 μL을 23.4 mL의 초순수 (25 °C에서 저항 18.2 MΩ.cm)를 추가하고 완전히 용해 될 때까지 저어줍니다 (적어도 1,000 rpm). TA의 빠른 용해를 위해 혼합물을 초음파 처리하십시오. 합성을 위해, 갓 준비된 TA 용액이 권장됩니다. 용액에 HAuCl4·3H2O(470 mg/mL)의 10.2 μL을 추가합니다. 15분 후, 격렬한 교반…

Representative Results

NIR PL AuNC는 TA의 존재 속에서 Au3+에서 제조된 후, 티올-종단 PEG(MW 2,000)를 AuNC 표면에 결합하여 도 1에도시된 워크플로우다음에 1 1을 얻었다. 아미딕 커플링 1 및 3-(아미노프로필) 트리페닐포스포늄(TPP) 브로마이드 제공 2. 예상대로, 흡수스펙트럼(도 2a)은AuNCs 1 및 2가 특징적인 표면 ?…

Discussion

NIR 방출 AuNCs는 금 전구체 용액(HAuCl4)을적합한 티올 리간드로 처리한 후Au3+의감소를 초래하는 상향식 접근법을 사용하여 합성하였다. 수성 용액에서 금속 이온의 감소는 응집되는 경향이 있으며 초소형 NCs21보다는큰 나노 입자를 초래합니다. 초소형(≤2 nm) PL AuNCs를 준비하기 위해 합성 조건을 조정하여 큰 입자의 형성을 방지하고 초소형 클러스터의 형성을 촉진?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 유세포측정에 대한 그녀의 도움에 대한 알츠베타 마돌레노바에 감사드립니다. 저자는 GACR 프로젝트 Nr. 18-12533S의 재정 지원을 인정합니다. 현미경 검사법은 유럽 지역 개발 기금과 체코 공화국의 국가 예산에 의해 공동 으로 자금을 조달공초점 및 형광 현미경 검사법의 실험실에서 수행되었다, 프로젝트 없음. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 및 CZ.2.16/3.1.00/21515, 체코-바이오이미징 대형 RI 프로젝트 LM2015062에 의해 지원됩니다.

Materials

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
  2. Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  3. Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
  4. Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
  5. Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry – An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
  6. Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
  7. Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
  8. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
  9. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
  10. Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
  11. Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
  12. Wu, Z., Jin, R. On the Ligand’s Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
  13. Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
  14. Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
  15. Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
  16. Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
  17. Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
  18. Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
  19. Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
  20. Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
  21. Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
  22. Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
  23. Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
  24. Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
  25. Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
  26. Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
  27. Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
  28. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
  29. Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
  30. Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
  31. Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
  32. Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
  33. Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
  34. Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
  35. Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
  36. Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
  37. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  38. Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
  39. Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
  40. Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
  41. Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
  42. Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).

Tags

Gold NanoclustersNear-infrared EmittingPhotoluminescentThiol-functionalized LigandAmine-functionalized LigandBiosensingBio-imagingUltrafiltrationPolyethylene GlycolEDC HCLCell Culture
check_url/60388?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image