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Bioengineering

近赤外線発光金ナノクラスターの生物応用のための合成

Published: March 22, 2020
doi:
10.3791/60388
, , , , , ,
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics,Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science,Charles University, 4First Faculty of Medicine,Charles University

Summary

可動性の高い、近赤外線発光光発光金ナノクラスターの調製法と、フローサイトメトリーおよび共焦点レーザー走査顕微鏡によるHeLa細胞内での直接検出の信頼性と再現性の高い方法について説明する。

Abstract

過去10年間、蛍光金ナノクラスター(AuNC)は生物学的用途で人気が高まっており、その開発に多大な努力が注がれてきました。本プロトコルでは、水溶性、生体適合性、およびコロイド的に安定な近赤外線発光AuNCの調製のための、最近開発されたファシリティ法が詳細に説明されている。この室温、ボトムアップ化学合成は水溶液のチオクチン酸およびチオール修飾ポリエチレングリコールで覆われた容易に機能可能なAuNCを提供する。合成アプローチでは、有機溶剤や追加のリガンド交換も、合成化学の広範な知識も必要ありません。結果として得られたAuNCは、フリー表面カルボン酸を提供し、AuNCの光発光特性に悪影響を及ぼすことなく、遊離アミン基を有する様々な生体分子で機能化することができる。HeLa細胞によるAuNC取り込みのフロー細胞量定量および共焦点顕微鏡イメージングのための迅速で信頼性の高い手順についても説明した。ストークスシフトが大きいため、AuNCの近赤外光発光を効率的に検出するには、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡におけるフィルタの適切な設定が必要です。

Introduction

過去10年間で、超小型(≤2 nm)光発光金ナノクラスター(PL AuNC)は、基礎研究と実用的な,,アプリケーション1、2、3、4、5、6、7、8、9、102,の両方の有望なプローブとして登場9,10しました3,4,5。6,78,1彼らの多くの望ましい特徴は高い写真安定性、調整可能な放出の極大さ、長い放出の寿命、大きいストークスのシフト、低い毒性、良い生物適合性、腎クリアランスおよびファシリティバイオコンジュゲーションを含んでいる。PLのAuNCは、青色から近赤外(NIR)スペクトル領域までの光発光を提供することができ、クラスター11内の原子の数および表面リガンド12の性質に応じて異なる。NIR(650-900 nm)を発するAUNCは、細胞および組織の長期的なインビトロおよびインビボイメージングにおいて特に有望であり、内在自家蛍光との重なりが最小、散乱と吸収の弱さ、およびNIR光13、14,14の高い組織浸透による高いシグナル対雑音比を提供する。

近年、種々のチオール含有リガンド13、15、16、17を用いたNIR-PL AuNCを調製するために15,16,17、Au-S共有結合相互作用を利用する様々なアプローチが開発されている。生物医学の応用のために、AuNCは結合相互作用を促進するために生物学的なコンポーネントによって機能化されなければならない。従って、水性溶媒中で容易に機能可能な高いコロイド安定性を有するオーNCが非常に望ましい。現在のプロトコルの全体的な目標は、水性環境下でチオクチン酸およびポリエチレングリコール(PEG)を詳細に採用し、酸アミンカップリング法に従って一次アミンを持つ分子との結合を使用して、表面に機能可能なカルボン酸基を有するAuNCの以前に報告された18の調製を記述することです。合成が容易で再現性が高いため、このプロトコルは非化学の背景を持つ研究者が使用し、適応することができます。

生物医学研究におけるAuNCの応用に必要な重要な条件の1つは、細胞内のAuNCを観察し測定する能力です。細胞によるナノ粒子の取り込み監視に利用できる方法のうち、フローサイトメトリー(FCM)および共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)は、多数の細胞19における蛍光ナノ材料の内在化を迅速に測定できる、堅牢で高スループットな方法を提供する。ここで、細胞内のPL AuNCを直接測定および分析するためのFCMおよびCLSM法は、追加の染料を必要とせず、また提示されている。

Protocol

1. 近赤外線発出オーNCの準備 (1) 7.8 mg(37.8 μmol)チオクチン酸(TA)と2M NaOHの60 μLを23.4mLの超純水(25°Cで抵抗率18.2 MΩ.cm)に加え、完全に溶解するまで(少なくとも1,000rpm)(少なくとも1,000rpm)をかき混ぜます(〜15〜20分)。TAの迅速な溶解のために、混合物を超音波処理します。合成には、作りたてのTA溶液が推奨される。 10.2 μL の HAuCl4・3H2O (470 mg/mL) の水溶液を溶液に加え…

Representative Results

NIR PL AuNCは、TAの存在下でAu3+から調製され、次いで、チオール終端PEG(MW 2,000)をAuNC表面に結合し、図1に示すワークフローに従って1を得た。1と3-(アミノプロピル)トリフェニルホスホニウム(TPP)ブロマイドの間のアミニックカップリングは2.予想通り、吸収スペクトル(図2a)は、AuNC11および<stro…

Discussion

NIR発光AuNCは、金前駆体溶液(HAuCl4)を適切なチオールリガンドで処理し4、続いてAu3+の還元を行うボトムアップアプローチを用いて合成した。水溶液中の金属イオンの還元は凝集する傾向があり、超小型NC21ではなく、大きなナノ粒子をもたらす。超小型(≤2 nm)PL AuNCを調製するために、合成条件を調整して大きな粒子の形成を防止し、超小クラスターの形成を?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、アルツベタ・マグドルレノワのフローサイトメトリーの助けに感謝している。著者らは、GACRプロジェクトNr.18-12533Sからの財政的支援を認めている。顕微鏡検査は、欧州地域開発基金とチェコ共和国の国家予算が共同出資した共焦点・蛍光顕微鏡研究所で行われました。CZ.1.05/4.1.00/16.0347およびCZ.2.16/3.1.00/21515、およびチェコバイオイメージング大RIプロジェクトLM2015062によってサポートされています。

Materials

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223
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References

  1. Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
  2. Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  3. Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
  4. Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
  5. Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry – An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
  6. Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
  7. Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
  8. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
  9. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
  10. Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
  11. Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
  12. Wu, Z., Jin, R. On the Ligand’s Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
  13. Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
  14. Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
  15. Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
  16. Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
  17. Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
  18. Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
  19. Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
  20. Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
  21. Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
  22. Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
  23. Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
  24. Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
  25. Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
  26. Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
  27. Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
  28. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
  29. Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
  30. Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
  31. Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
  32. Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
  33. Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
  34. Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
  35. Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
  36. Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
  37. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  38. Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
  39. Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
  40. Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
  41. Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
  42. Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).

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Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).
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