JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Syntes av nära infraröd avgivande guld nanokluster för biologiska tillämpningar

Published: March 22, 2020
doi:
10.3791/60388
, , , , , ,
1Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, 2Department of Chemical Physics and Optics, Faculty of Mathematics and Physics,Charles University, 3Department of Cell Biology, Faculty of Science,Charles University, 4First Faculty of Medicine,Charles University

Summary

En tillförlitlig och lätt reproducerbar metod för beredning av functionalizable, nära infraröd avgivande fotoluminescerande guld nanokluster och deras direkta detektion inuti HeLa celler genom flöde cytometri och confocal laser scanning mikroskopi beskrivs.

Abstract

Under det senaste årtiondet har fluorescerande guld nanokluster (AuNCs) bevittnat växande popularitet i biologiska tillämpningar och enorma ansträngningar har ägnats åt deras utveckling. I detta protokoll har en nyligen utvecklad, facile metod för beredning av vattenlösliga, biokompatibla och kolloidalt stabil nära infraröd avgivande AuNCs beskrivits i detalj. Denna rumstemperatur, nedifrån och upp kemisk syntes ger lätt funktionelliserbara AuNCs täckt med tiooktsyra och tioolmodifierad polyetylenglykol i vattenlösning. Den syntetiska metoden kräver varken organiska lösningsmedel eller ytterligare ligand utbyte eller omfattande kunskap om syntetisk kemi att reproducera. De resulterande AuNCs erbjuder gratis yta karboxylsyra, som kan funktionaliseras med olika biologiska molekyler som bär en fri amin grupp utan att negativt påverka de fotoluminescerande egenskaperna hos AuNCs. Ett snabbt, tillförlitligt förfarande för flöde cytometrisk kvantifiering och confocal mikroskopisk avbildning av AuNC upptag av HeLa celler också beskrivits. På grund av den stora Stokes skift, korrekt inställning av filter i flöde cytometri och konfokalmikroskopi är nödvändigt för effektiv detektion av nära infraröd fotoluminescens av AuNCs.

Introduction

Under det senaste årtiondet har ultrasmå (≤ 2 nm) fotoluminescerande nanokluster i guld (PL AuNCs) framträtt som lovande sonder för både grundforskning och praktiska tillämpningar1,,2,,3,4,,5,,6,,,7,,8,,9,10. Deras många önskvärda egenskaper inkluderar hög fotostabilitet, avstämbara utsläpp maxima, långa utsläpp livstider, stora Stokes skift, låg toxicitet, god biokompatibilitet, renal clearance och facile bioconjugation. PL AunCs kan ge fotoluminescens från det blå till nära infraröda (NIR) spektralområdet, beroende på antalet atomer i klustret11 och arten av ytan ligand12. NIR (650-900 nm) avger AuNCs är särskilt lovande för långsiktiga in vitro och in vivo imaging av celler och vävnader, eftersom de erbjuder hög signal-brus förhållande på grund av minsta överlappning med inneboende autofluorescens, svagare spridning och absorption, och hög vävnad penetration av NIR ljus13,14.

Under de senaste åren har olika metoder som utnyttjar Au-S kovalenta interaktioner utvecklats för att förbereda NIR-PL AuNCs begränsas med en mängd tiool-innehållande ligander13,,15,16,17. För biomedicinska tillämpningar måste Auncs funktionaliseras med en biologisk komponent för att underlätta bindande interaktioner. Således auncs med hög kolloidal stabilitet som är lätt functionalizable i vattenlösningsmedel är mycket önskvärt. Det övergripande målet med det nuvarande protokollet är att beskriva en tidigare rapporterade18 beredning av AuNCs med en functionalisable karboxylsyra grupp på ytan genom att använda tiooktic syra och polyetylenglykol (PEG) i en vattenmiljö i detalj och deras konjugering med molekyler som bär en primär amin efter syra-amin kopplingsmetod. På grund av enkel syntes och hög reproducerbarhet, kan detta protokoll användas och anpassas av forskare från icke-kemi bakgrunder.

En av de viktigaste förfrågeför tillämpningar av AuNCs i biomedicinsk forskning är förmågan att observera och mäta AuNCs inuti celler. Bland de metoder som finns tillgängliga för att övervaka nanopartikelupptag av celler, flödescytometri (FCM) och konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM) erbjuder robusta, hög genomströmning metoder som möjliggör snabba mätningar av internalisering av fluorescerande nanomaterial i stort antal celler19. Här har fcm och CLSM-metod för direkt mätning och analys av PL AuNCs inuti celler, utan behov av ytterligare färgämnen, också presenterats.

Protocol

1. Förberedelse av nära infraröda avgivande AuNCs (1) Tillsätt 7,8 mg (37,8 μmol) tiookt syra (TA) och 60 μl 2 M NaOH till 23,4 ml ultrapurevatten (resistivitet 18,2 MΩ.cm vid 25 °C) och rör om (minst 1 000 varv/min) tills det löser sig helt (~15-20 min). För snabbare upplösning av TA, sonikera blandningen. För syntes rekommenderas nyberedd TA-lösning. Tillsätt 10,2 μl HAuCl4·3H2O (470 mg/ml) vattenlösning till lösningen. Efter 15 minuter tillsätt 48…

Representative Results

NIR PL AuNCs utarbetades från Au3 + i närvaro av TA, och sedan thiol-avslutade PEG (MW 2.000) var bunden på AuNC ytan för att få 1 efter arbetsflödet som visas i figur 1. Amidkoppling mellan 1 och 3-(aminopropyl) trifenylfosfonium (TPP) bromid förutsatt 2. Som väntat visade absorptionsspektra (figur 2a) att AuNCs 1 och 2 inte har ett karakteristiskt ytplasmonb…

Discussion

NIR-avgivande AuNCs syntetiserades med hjälp av en bottom-up-strategi där guldprekursorlösningen (HAuCl4)behandlades med lämpliga tiolligander, följt av en minskning av Au3+. Minskning av metalljoner i vattenlösning tenderar att aggregera och resulterar i stora nanopartiklar snarare än ultrasmå NCs21. För att förbereda ultrasmå (≤2 nm) PL AuNCs justerades de syntetiska förhållandena för att förhindra bildandet av stora partiklar och främja bildandet av ultra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna är tacksamma mot Alzbeta Magdolenova för hennes hjälp med flödescytometri. Författarna erkänner det ekonomiska stödet från GACR-projektet Nr. 18-12533S. Mikroskopi utfördes i laboratoriet för konfuktal- och fluorescensmikroskopi som medfinansierades av Europeiska regionala utvecklingsfonden och Tjeckiens statsbudget, projekt nr. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 och CZ.2.16/3.1.00/21515, och stöds av det tjeckisk-BioImaging stora RI-projektet LM2015062.

Materials

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
  2. Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  3. Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
  4. Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
  5. Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry – An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
  6. Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
  7. Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
  8. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
  9. Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
  10. Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
  11. Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
  12. Wu, Z., Jin, R. On the Ligand’s Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
  13. Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
  14. Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
  15. Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
  16. Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
  17. Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
  18. Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
  19. Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
  20. Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
  21. Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
  22. Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
  23. Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
  24. Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
  25. Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
  26. Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
  27. Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
  28. Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
  29. Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
  30. Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
  31. Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
  32. Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
  33. Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
  34. Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
  35. Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
  36. Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
  37. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  38. Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
  39. Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
  40. Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
  41. Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
  42. Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).

Tags

Keywords: Gold NanoclustersNear-infrared EmittingPhotoluminescentThiol-functionalized LigandAmine-functionalized LigandBiosensingBio-imagingUltrafiltrationPolyethylene GlycolEDC HCLCell Culture
check_url/60388?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image