다세포 3차원 스페로이드 생성을 위한 랩 온 어 CD 플랫폼
Summary
우리는 세포 스페로이드를 재배 할 수있는 모터 구동 원심 미세 유체 장치를 제시합니다. 이 장치를 사용하여, 단일 또는 다중 세포 모형의 스페로이드는 높은 중력 조건 하에서 쉽게 cocultured 될 수 있었습니다.
Abstract
3차원 스페로이드 세포 배양은 2차원 세포 배양보다 생체의 세포 미세 환경을 더 잘 시뮬레이션할 수 있기 때문에 세포 실험에서 더 유용한 결과를 얻을 수 있다. 이 연구에서는 높은 원심력을 구현하는 3차원(3D) 세포 스페로이드를 만들기 위해 원심 미세유체 기반 스페로이드(CMS) 배양 시스템이라고 하는 전기 모터 구동 실험실 온 어 CD(소형 디스크) 플랫폼을 제작했습니다. 이 장치는 회전 속도가 다양하여 1 x g에서 521 x g까지의 중력 조건을 생성할 수 있습니다. CMS 시스템은 직경이 6cm이며, 100 400 μm 마이크로웰을 가지고 있으며, 컴퓨터 수치 제어 기계에 의해 미리 만들어진 폴리 카보네이트 금형에서 폴리 디메틸 실록산으로 성형하여 만들어집니다. CMS 시스템의 채널 입구의 장벽은 원심력을 사용하여 칩 내부에 세포를 고르게 퍼질 수 있습니다. 채널의 끝에는 세포가 마이크로웰에 들어갈 수 있는 슬라이드 영역이 있습니다. 시연으로, 스페로이드는 시스템을 사용하여 높은 중력 조건 하에서 인간 지방 유래 줄기 세포 및 인간 폐 섬유아세포의 단일 배양 및 공동 배양에 의해 생성되었다. CMS 시스템은 동심, 야누스 및 샌드위치의 다양한 구조의 공동 배양 스페로이드를 생산하기 위해 간단한 작업 방식을 사용했습니다. CMS 시스템은 단일 또는 다중 세포 유형의 스페로이드 및 오르가노이드 배양을 필요로 하는 세포 생물학 및 조직 공학 연구에서 유용할 것입니다.
Introduction
2차원(2D) 세포 배양(예: 기존의 페트리 접시 세포 배양)보다 3차원(3D) 스페로이드 세포 배양으로 생체 내 미세 환경을 시뮬레이션하여 보다 생리적으로 현실적인 실험을 생성하는 것이 더 쉽습니다. 결과1. 현재 이용 가능한 스페로이드 형성 방법은 매달려 낙하 기술2,액체 오버레이 기술3,카르복시메틸 셀룰로오스 기술4,자기 힘 기반 미세 유체 기술5,및 의 사용을 포함한다 생물 반응기6. 각 방법은 고유한 이점이 있지만 재현성, 생산성 및 공동 배양 스페로이드 생성의 추가 개선이 필요합니다. 예를 들어, 자기력 기반 미세 유체 기술5는 상대적으로 저렴하지만 살아있는 세포에 대한 강한 자기장의 영향을 신중하게 고려해야합니다. 스페로이드 배양의 이점은, 특히 중간엽 줄기세포 분화 및 증식의 연구에서, 여러 연구에서7,8,9에보고되었다.
또한 실험실에 CD (컴팩트 디스크)로 알려진 원심 미세 유체 시스템은 쉽게 내부 유체를 제어하고 기판의 회전을 악용하는 데 유용하고, 따라서 면역 분석과 같은 생체 의학 응용 프로그램에 활용되고있다10, 생화학적 마커11,핵산 증폭(PCR) 분석법, 자동 혈액 분석 시스템12,올인원 원심 미세유체 장치13. 유체를 제어하는 구동력은 회전에 의해 생성되는 구심력입니다. 또한 이 단일 CD 플랫폼에서 혼합, valving 및 샘플 분할의 여러 기능을 간단하게 수행할 수 있습니다. 그러나, 전술한 생화학적 분석 방법에 비해, 배양 세포, 특히스페로이드(14)에CD 플랫폼을 적용하는 시험이 적어왔다.
본 연구에서, 우리는 인간 지방 유래 줄기 세포 (hASC) 및 인간 폐 섬유 아세포 (MRC-5)의 단일 배양 또는 공동 배양에 의한 원심 미세 유체 기반 스페로이드 (CMS) 시스템의 성능을 보여줍니다. 이 백서에서는 그룹의 연구 방법론15에대해 자세히 설명합니다. 따라서, 스페로이드 배양 실험실-온-어-CD 플랫폼은 용이하게 재현될 수 있다. CMS 배양 칩, 칩 홀더, DC 모터, 모터 마운트 및 회전 플랫폼을 포함하는 CMS 생성 시스템이 제시된다. 모터 마운트는 아크릴로니트리리 부타디엔 스티렌 (ABS)으로 3D 인쇄됩니다. 칩 홀더와 회전 플랫폼은 PC(폴리카보네이트)로 가공된 CNC(컴퓨터 수치 제어)입니다. 모터의 회전 속도는 펄스 폭 변조에 기초한 PID(비례-적분-유도체) 알고리즘을 인코딩하여 200rpm에서 4,500rpm으로 제어됩니다. 크기는 100mm x 100mm x 150mm이며 무게는 860g으로 취급이 용이합니다. CMS 시스템을 사용하여 스페로이드는 1 x g에서 521 x g까지다양한 중력 조건하에서 생성 될 수 있으므로 고중력하에서 세포 분화 촉진에 대한 연구는 2D 셀16,17에서 3D로 확장 될 수 있습니다. 스페로이드. 다양한 유형의 세포의 동배도 생체 내 환경을 효과적으로 모방하는 핵심 기술이기도합니다(18). CMS 시스템은 다양한 구조 유형(예: 동심, 야누스 및 샌드위치)의 공동 배양 스페로이드뿐만 아니라 단일 배양 스페로이드를 쉽게 생성할 수 있습니다. CMS 시스템은 간단한 스페로이드 연구뿐만 아니라 인간의 장기 구조를 고려하기 위해 3D 오르가노이드 연구에서도 활용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CMS는 모든 주입 된 세포가 폐기물없이 마이크로 웰에 들어가는 폐쇄 시스템으로 기존의 마이크로 웰 기반 스페로이드 생성 방법보다 효율적이고 경제적입니다. CMS 시스템에서, 매 12-24시간마다 칩 내의 매체를 제거하도록 설계된 흡입 구멍을 통해 미디어가 교체된다(도3A). 미디어 흡입 과정에서, 거의 모든 매체는 마이크로웰의 매체와 벽 사이의 표면 장력으로 인해 마이크?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NRF의 기초 과학 연구 프로그램(2016R1D1A1A1A1B0333418)과 NRF의 바이오 및 의료 기술 개발 프로그램(2018M3A9H1023141)에 의해 지원되었으며, 한국 정부, MSIT의 지원을 받았습니다.
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
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