Lab-on-a-CD plattform for generering flercellede tredimensjonal Spheroids

Summary

Vi presenterer en motor drevet sentrifugal mikrovæskebasert innretning som kan dyrke celle spheroids. Ved hjelp av denne enheten, kan spheroids av én eller flere celletyper lett cocultured under høy gravitasjon forhold.

Abstract

En tredimensjonal spheroid cellekultur kan få mer nyttige resultater i celle eksperimenter fordi det kan bedre simulere celle microenvironments av den levende kroppen enn to-dimensjonal cellekultur. I denne studien, fabrikkert vi en elektrisk motor-drevet Lab-on-a-CD (Compact Disc) plattform, kalt en sentrifugal mikrovæskebasert-baserte spheroid (CMS) kultur system, for å lage tredimensjonale (3D) celle spheroids implementere høy sentrifugalkraft. Denne enheten kan variere rotasjonshastighet for å generere tyngdekraft forhold fra 1 x g til 521 x g. CMS-systemet er 6 cm i diameter, har 500 μm microwells, og er laget av molding med Polydimethylsiloxan i en polykarbonat mold forhåndslagde av en datamaskin numerisk kontroll maskin. En barriere vegg ved kanal inngangen til CMS-systemet bruker sentrifugalkraften til å spre celler jevnt inne i brikken. På slutten av kanalen, det er en skyve område det innrømmer cellene å gå inn det microwells. Som en demonstrasjon, spheroids ble generert av monokultur og coculture av menneskelig fett-avledet stamceller og menneskelige lunge fibroblaster under høy gravitasjon forhold ved hjelp av systemet. CMS-systemet brukte en enkel operasjon ordning for å produsere coculture spheroids av ulike strukturer i konsentriske, Janus, og sandwich. CMS-systemet vil være nyttig i cellebiologi og vev engineering studier som krever spheroids og organoid kultur av én eller flere celletyper.

Introduction

Det er lettere å simulere biologisk in vivo microenvironments med tredimensjonal (3D) spheroid cellekultur enn med to-dimensjonale (2D) cellekultur (for eksempel konvensjonelle Petri parabol cellekultur) for å produsere mer fysiologisk realistisk eksperimentell resultater¹. Foreløpig tilgjengelig spheroid formasjon metoder inkluderer hengende slipp teknikk², Liquid-overlay teknikk³, carboxymethyl cellulose teknikk⁴, magnetisk Force-baserte mikrovæskebasert teknikk⁵, og bruk av bioreaktorer⁶. Selv om hver metode har sine egne fordeler, er det nødvendig med ytterligere forbedring i reproduserbarhet, produktivitet og generering av coculture spheroids. For eksempel, mens den magnetiske Force-baserte mikrovæskebasert teknikk⁵ er relativt billig, effekten av sterke magnetiske felt på levende celler må vurderes nøye. Fordelene med spheroid kultur, spesielt i studiet av mesenchymal stilk cellen differensiering og spredning, er rapportert i flere studier^7,8,9.

Sentrifugal mikrovæskebasert systemet, også kjent som Lab-on-a-CD (CD-plate), er nyttig for enkelt å kontrollere væsken inne og utnytte rotasjonen av underlaget og har dermed blitt utnyttet i biomedisinsk applikasjoner som immunanalyser¹⁰, fargemetrisk analyse for å oppdage biokjemiske markører¹¹, nukleinsyre acid forsterkning (PCR) analyser, automatiserte blod analyse systemer¹²og alt-i-ett sentrifugal mikrovæskebasert enheter¹³. Drivkraften som kontrollerer væsken er den sentripetal kraften som skapes ved rotasjon. Ytterligere, mangfoldig funksjonene av blander, valving, og eksemplar splitting kan gjort bare i denne enkelt CD plattform. Men sammenlignet med de ovenfor nevnte biokjemiske analysemetoder, har det vært færre forsøk å bruke CD-plattformer til kultur celler, spesielt spheroids¹⁴.

I denne studien viser vi ytelsen til sentrifugal mikrovæskebasert-baserte spheroid (CMS)-systemet ved monokultur eller coculture av humane fett avledede stamceller (hASC) og humant lunge fibroblaster (MRC-5). Dette dokumentet beskriver i detalj vår gruppes forskningsmetode¹⁵. Således, det spheroid kulturen laboratorium-opp på-en-CD plattform kan lett reprodusert. En CMS genererer system bestående av et CMS kultur chip, en chip holder, en DC motor, en motor Mount, og en roterende plattform, er presentert. Motor braketten er 3D trykt med akrylnitril butadien styren (ABS). Chip holder og roterende plattform er CNC (datamaskin numerisk kontroll) bearbeidet med PC (polykarbonat). Rotasjonshastigheten til motoren styres fra 200 til 4 500 RPM ved å kode en PID (proporsjonal-Integral-derivat) algoritme basert på puls-bredde moduleringshjul. Dens dimensjoner er 100 mm x 100 mm x 150 mm og den veier 860 g, noe som gjør det enkelt å håndtere. Ved hjelp av CMS-systemet, kan spheroids genereres under ulike tyngdekraften forhold fra 1 x g til 521 x g, så studiet av celle differensiering forfremmelse under høy gravitasjon kan utvides fra 2D-celler^16,17 til 3D spheroid. Coculture av ulike typer celler er også en viktig teknologi for effektivt å etterligne in vivo miljø¹⁸. Det CMS system kanne lett utvikle monokultur spheroids, likeledes idet coculture spheroids av forskjellige struktur typer (e.g., konsentrisk, Janus, og sandwich). CMS-systemet kan utnyttes ikke bare i enkle spheroid studier, men også i 3D-organoid studier, for å vurdere menneskelige organ strukturer.

Protocol

1. sentrifugal mikrovæskebasert-basert spheroid (CMS) kultur chip fabrikasjon Lag PC muggsopp for toppen og bunnen lag av CMS kulturen chip av CNC maskinering. Detaljerte dimensjoner av brikken er gitt i figur 1. Bland PDMS base og PDMS herding agent i forholdet 10:1 (w/w) i 5 min og plasser i en desikator for 1 t for å fjerne luftbobler. Etter støping av PDMS blandingen i formene av CMS kultur chip, fjerne luftbobler for 1 t mer og kur i et varme kammer ved …

Representative Results

Den 6 cm diameter CMS kultur chip (figur 2) ble vellykket gjort etter ovennevnte protokollen. Først ble brikken laget separat fra et topplag og et nederste lag, og deretter limt sammen av plasma binding. Resulterende spheroids kan enkelt samles ved å løsne chip. Kanalen for CMS kultur chip består av en innløps port og sentrale, slide, og mikrotiterplateleser regioner (Figur 3). Celle-, medium-og pluronic-løsninger injiseres gjennom et innløps hull med en …

Discussion

CMS er et lukket system der alle injisert celler inn i mikrotiterplateleser uten avfall, noe som gjør den mer effektiv og økonomisk enn konvensjonelle mikrotiterplateleser-baserte spheroid generasjon metoder. I CMS-systemet erstattes mediene hver 12 – 24 h gjennom et suge hull som er utformet for å fjerne mediene i brikken (figur 3a). Under Media suge prosessen, unnslipper knapt noen medier fra innsiden av mikrotiterplateleser på grunn av overflatespenningen mellom mediene og veggen av…

Materials

3D printer	Cubicon	3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)	ATCC	PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
DC motor	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020	Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm	JetBiofill	CAD010150	Surface Treated
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC)	Acrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Trypsin	Gibco	12604021