Lab-på-en-CD plattform för att generera Multicellulära tredimensionell spheroids
Summary
Vi presenterar en motordriven centrifugal mikroflödessystem enhet som kan odla cellspheroids. Med hjälp av denna enhet, spheroids av enstaka eller flera celltyper kan lätt coculodlas under hög gravitation villkor.
Abstract
En tredimensionell sfäroid cellkultur kan få mer användbara resultat i cell experiment eftersom det kan bättre simulera cell mikromiljöer i den levande kroppen än tvådimensionell cellkultur. I denna studie, vi fabricerade en elektrisk motor driven Lab-på-en-CD (Compact Disc) plattform, kallad en centrifugal microfluidic-baserade sfäroid (CMS) kultur system, att skapa tredimensionella (3D) cell spheroids genomföra hög centrifugalkraft. Denna enhet kan variera rotationshastigheter för att generera gravitation villkor från 1 x g till 521 x g. CMS-systemet är 6 cm i diameter, har 500 μm mikrobrunnar, och görs genom gjutning med Polydimetylsiloxan i en polykarbonat mögel premade av en dator numerisk kontroll maskin. En barriär vägg vid kanal ingången i CMS-systemet använder centrifugalkraft för att sprida celler jämnt inuti chipet. I slutet av kanalen finns en bild region som gör att cellerna kan komma in i mikrobrunnarna. Som en demonstration, spheroids genererades av monokultur och samodling av mänskliga adipose-härledda stamceller och mänskliga lung fibroblaster under hög gravitation villkor med hjälp av systemet. CMS-systemet används ett enkelt operativsystem för att producera coculture spheroids av olika strukturer av Concentric, Janus och Sandwich. CMS-systemet kommer att vara användbart i cellbiologi och vävnadstekniska studier som kräver spheroids och Organoid kultur av en eller flera celltyper.
Introduction
Det är lättare att simulera biologiska in vivo mikromiljöer med tredimensionell (3D) sfäroid cellkultur än med två-dimensionell (2D) cellkultur (t. ex. konventionell petriskål cellkultur) för att producera mer fysiologiskt realistiska experimentella resultat1. För närvarande tillgängliga sfäroid formation metoder inkluderar hängande droppe teknik2, vätska-overlay teknik3, karboxymetyl cellulosa teknik4, magnetisk kraft-baserade mikroflödessystem teknik5, och användning av bioreaktorer6. Även om varje metod har sina egna fördelar, ytterligare förbättring av reproducerbarhet, produktivitet, och generera coculture spheroids är nödvändigt. Till exempel, medan den magnetiska kraft-baserade mikroflödessystem teknik5 är relativt billigt, effekterna av starka magnetfält på levande celler måste noga övervägas. Fördelarna med sfäroid kultur, särskilt i studiet av mesenkymala stamceller differentiering och proliferation, har rapporterats i flera studier7,8,9.
Den centrifugal mikroflödessystem system, även känd som Lab-on-a-CD (Compact Disc), är användbart för att enkelt kontrollera vätskan inuti och utnyttja rotation av substratet och har därmed utnyttjats i biomedicinska tillämpningar såsom immunanalyser10, kolorimetriska analyser för detektion av biokemiska markörer11, test av nukleinsyramplifiering (PCR), automatiserade blodanalys system12, och allt-i-ett centrifugalmikrofluidiska enheter13. Den drivande kraften som styr vätskan är den centripetala kraft som skapas genom rotation. Dessutom kan flera funktioner för blandning, valving, och prov uppdelning göras helt enkelt i denna enda CD-plattform. Jämfört med de ovan nämnda biokemiska analysmetoderna har det dock förekommit färre försök att använda CD-plattformar för att odla celler, särskilt spheroids14.
I denna studie visar vi prestanda för centrifugalmikrofluidic-baserade sfäroid (CMS) system genom monokultur eller samodling av mänskliga adipose härledda stamceller (hASC) och mänskliga lung fibroblaster (MRC-5). Denna uppsats beskriver i detalj vår grupps forskningsmetodik15. Således kan sfäroid Culture Lab-on-a-CD-plattformen enkelt återges. Ett CMS-system bestående av ett CMS-kulturchip, en chip-hållare, en likströmsmotor, ett motor fäste och en roterande plattform presenteras. Motor fästet är 3D-tryckt med akrylnitril-butadienstyren (ABS). Chip hållaren och roterande plattform är CNC (Computer numerisk kontroll) bearbetas med PC (polykarbonat). Motorns rotationshastighet styrs från 200 till 4 500 rpm genom kodning av en PID-algoritm (proportionell-integral-derivata) baserad på pulsbredd modulering. Dess mått är 100 mm x 100 mm x 150 mm och den väger 860 g, vilket gör den lätt att hantera. Använda CMS-systemet, spheroids kan genereras under olika gravitation villkor från 1 x g till 521 x g, så studiet av celldifferentiering befordran under hög gravitation kan förlängas från 2D-celler16,17 till 3D sfäroid. Samodling av olika typer av celler är också en viktig teknik för att effektivt imitera in vivo miljö18. CMS-systemet kan enkelt generera monokultur spheroids, liksom samodling spheroids av olika struktur typer (t. ex., Concentric, Janus, och Sandwich). CMS-systemet kan utnyttjas inte bara i enkla sfäroid studier utan även i 3D Organoid studier, att överväga mänskliga organ strukturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
CMS är ett slutet system där alla injicerade celler in i mikrobrunn utan avfall, vilket gör det mer effektivt och ekonomiskt än konventionella mikrobrunn-baserade sfäroid generation metoder. I CMS-systemet byts Media varje 12 – 24 h genom ett sughål som är utformat för att ta bort materialet i chippet (figur 3a). Under Media sug processen, knappt någon Media flyr inifrån mikrobrunn på grund av ytspänningen mellan media och väggen i mikrobrunn. En användare kan enkelt ta bort …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Basic Science Research program (2016R1D1A1B03934418) och bio & medicinsk teknik Development program (2018M3A9H1023141) av NRF, och finansieras av den koreanska regeringen, MSIT.
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -. S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
