JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Published: October 13, 2019
doi:
10.3791/60415
, , , , ,
1Department of Biomedical Sciences,Korea University, 2Department of Mechanical Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health,Harvard T.H. Chan School of Public Health

Summary

Gelişimkolektif hücre göçü, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı genellikle büyüme faktörleri veya sinyal moleküllerinin gradyanları tarafından yönlendirilir. Burada açıklanan bir mikroakışkan sistem ve biyokimyasal gradyan altında kolektif göç mekaniği ölçmek için nasıl bir gösteri ile çekiş mikroskobu birleştiren deneysel bir sistemdir.

Abstract

Hücreler kimyasal uyaranlara yanıt olarak göç desenlerini değiştirirler, uyaranların degradeleri de dahil olmak üzere. Kemotaksis olarak bilinen kimyasal degrade yönünde hücresel göç, gelişiminde önemli bir rol oynar, bağışıklık yanıtı, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı. Kemotaksis tek hücre göçünün yanı sıra in vivo hücre koleksiyonlarını modüle ederken, in vitro araştırma kısmen uygun deneysel araçların eksikliği nedeniyle, tek hücreli kemotaksis üzerinde duruluyor. Bu boşluğu doldurmak için, burada açıklanan kolektif hücre göçü üzerinde kimyasal degradelerin etkilerini göstermek için mikroakışkan ve mikro desenleme birleştiren benzersiz bir deneysel sistemdir. Ayrıca, traksiyon mikroskobu ve monolayer stres mikroskobu, substrattaki ve komşu hücreler arasındaki hücresel kuvvet değişikliklerini karakterize etmek için sisteme dahil edilmiştir. Kavram kanıtı olarak, Madin-Darby köpek böbrek (MDCK) hücrelerinin mikro desenli dairesel adaların göçü, bilinen bir saçılma faktörü olan hepatosit büyüme faktörü (HGF) gradyanı altında test edilir. HGF’nin yüksek konsantrasyonuna yakın hücreler, bir hücre adası içinde karşı taraftakihücrelerden daha hızlı göç eder. Aynı ada içinde, hücresel çekiş her iki tarafta benzer, ancak hücreler arası stres yüksek HGF konsantrasyonu tarafında çok daha düşüktür. Bu yeni deneysel sistem hücresel kolektifler tarafından kemotaktik göç mekaniği çalışma için yeni fırsatlar sağlayabilir.

Introduction

Biyolojik sistemlerde hücresel göç doku oluşumunda yer alan temel bir olgudur, bağışıklık yanıtı, ve yara iyileşmesi1,2,3. Hücresel göç de kanser gibi bazı hastalıklarda önemli bir süreçtir4. Hücreler genellikle toplu hücre geçişi4,5olarak bilinen tek tek yerine bir grup olarak göç. Hücrelerin kolektif olarak hareket edilebisolması için mikroortamın algılanması6esastır. Örneğin, hücreler fizyokimyasal uyaranları algılar lar ve hareketliliği, hücre-substrat etkileşimlerini ve hücre-hücre etkileşimlerini değiştirerek yanıt verirler, bu da kimyasal bir degrade boyunca yön göçüne neden olur7,8, 9,10. Bu bağlantıya dayanarak, hızlı gelişmeler bir chemoattractant11,12,13 gradyanı gibi iyi kontrollü kimyasal mikroortamlar oluşturabilirsiniz lab-on-a-chip teknolojilerinde yapılmıştır . Bu laboratuvar-on-a-çip tabanlı mikroakışkanlar daha önce hücresel topluluk veya hücresel küresel ler14,15,16,17kemotaksis çalışma için kullanılmış olsa da, onlar çoğunlukla tek hücreli geçiş bağlamında kullanılmıştır18,19,20,21. Kimyasal degradeye hücresel kolektif yanıtın altında yatan mekanizmalar hala iyi anlaşılamamıştır14,22,23,24,25,26 . Böylece, çözünen faktörlerin spatiotemporal kontrolü sağlayan bir platform geliştirilmesi yanı sıra hücrelerin biyofiziksel yerinde gözlem kolektif hücre göçü arkasındaki mekanizmaları çözmek için yardımcı olacaktır.

Burada geliştirilen ve açıklanan desenli hücre kümelerinin göç modüle çözünür faktörlerin bir konsantrasyon gradyanı üretimi sağlayan çok kanallı mikroakışkan bir sistemdir. Bu çalışmada Madin-Darby kan böbrek (MDCK) hücrelerinin göç davranışını düzenlemek için hepatosit büyüme faktörü (HGF) seçilmiştir. HGF hücre-hücre bütünlüğünü zayıflatmak ve hücrelerin hareketliliğini artırmak bilinmektedir27,28. Mikroakışkan sistemde, Fourier transform traksiyon mikroskobu ve monolayer stres mikroskobu da dahil edilmiştir, bu da bir HGF’ye yanıt olarak kurucu hücreler tarafından indüklenen hareketlilik, kontraktil kuvvet ve hücreler arası gerilimin analizine olanak sağlar. Degrade. Aynı ada içinde, HGF yüksek konsantrasyonyakınında bulunan hücreler daha hızlı göç ve düşük HGF konsantrasyonu ile tarafında daha düşük hücreler arası stres düzeyleri göstermektedir. Sonuçlar, bu yeni deneysel sistemin çeşitli çözünür faktörlerin kimyasal degradeleri altında kolektif hücresel göçü içeren alanlardaki diğer soruları araştırmak için uygun olduğunu göstermektedir.

Protocol

NOT: Şablonlar (kalınlık = 250 μm) ve mikrokanal parçaları (kalınlık = 150 μm), cam gravür (derinlik = 100 μm) ve döküm imalatı için SU-8 kalıplarının litografisi, üreticilere bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılarak tasarımlar gönderilerek dış kaynak tanyapılmıştır. 1. Polidimethylsiloxane (PDMS) şablon ve mikrokanal imalatı Şablon ve mikrokanalın mikro deseni tasarla. Silikon gofretler (4″ çap) üzerinde SU-8 kalıpları (şab…

Representative Results

Kimyasal bir degrade altında kolektif göçü araştırmak için, mikroakışkan bir sistem çekiş mikroskobu ile bütünleşmiştir(Şekil 1). Entegre sistemi oluşturmak için, poliakrilamid (PA) jel özel kesim cam üzerine atıldı ve MDCK hücreleri bir PDMS şablon tarafından yapılan mikro desenli adalar içinde tohumlu edildi. Bu deney için, MDCK hücrelerinden oluşan on iki ada (üç sütuna dört sıra, çapı ~700 μm) oluşturuldu. PA jellere bağlı hücrelerden sonra, topl…

Discussion

Kurucu hücrelerin kolektif göçü geliştirme ve rejenerasyon sırasında önemli bir süreçtir ve göç yönü genellikle büyüme faktörlerinin kimyasal degrade tarafından yönlendirilir4,23. Toplu geçiş sırasında hücreler komşu hücrelerle ve altta yatan alt tabakalarla etkileşime devam eder. Bu tür mekanik etkileşimler durotaksis42, plithotaxis33ve kenotaxis43gibi acil fenom…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Kore Hükümeti (MSIP) (No) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) hibe tarafından desteklenmiştir. NRF-2017R1E1A1A01075103), Kore Üniversitesi Hibeve BK 21 Plus programı. Ayrıca Ulusal Sağlık Enstitüleri (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696) tarafından desteklenmiştir.

Materials

0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 041918 (2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Tags

Keywords: Traction MicroscopyMicrofluidicsCollective Cell MigrationBiochemical GradientCellular ForcesPDMSSU-8 MoldGlass Slide SilanizationPolyacrylamide Gel
check_url/60415?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image