JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Traction mikroskopi integrert med materialer for chemotactic kollektiv migrasjon

Published: October 13, 2019
doi:
10.3791/60415
, , , , ,
1Department of Biomedical Sciences,Korea University, 2Department of Mechanical Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health,Harvard T.H. Chan School of Public Health

Summary

Kollektive celle migrasjon i utvikling, sår helbredelse, og kreft metastasering er ofte guidet av graderinger av vekstfaktorer eller signalering molekyler. Beskrevet her er et eksperimentelt system som kombinerer trekkraft mikroskopi med et mikrovæskebasert system og en demonstrasjon av hvordan å kvantifisere mekanikken i kollektiv migrasjon under biokjemiske gradient.

Abstract

Celler endre migrasjon mønstre som svar på kjemiske stimuli, inkludert graderinger av stimuli. Cellular migrasjon i retning av en kjemisk gradient, kjent som chemotaxis, spiller en viktig rolle i utviklingen, immunforsvaret respons, sår helbredelse, og kreft metastasering. Mens chemotaxis modulerer migrering av enkeltceller, samt samlinger av celler in vivo, fokuserer in vitro forskning på enkelt celle chemotaxis, delvis på grunn av mangelen på riktig eksperimentelle verktøy. For å fylle dette gapet, beskrevet her er en unik eksperimentell system som kombinerer materialer og micropatterning å demonstrere virkningene av kjemiske graderinger på kollektiv celle migrasjon. Videre er trekkraft mikroskopi og monolag stress mikroskopi innlemmet i systemet for å karakterisere endringer i cellulær kraft på underlaget så vel som mellom naboceller. Som proof-of-konseptet, er migrasjon av micropatterned sirkulære øyer av Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler testet under en gradient på hepatocytter vekstfaktor (HGF), en kjent spredning faktor. Det er funnet at celler som ligger i nærheten av høyere konsentrasjon av HGF migrere raskere enn de på motsatt side i en celle øy. Innenfor samme øy, er cellulær trekkraft lik på begge sider, men intercellulære stress er mye lavere på siden av høyere HGF konsentrasjon. Denne romanen eksperimentelle systemet kan gi nye muligheter til å studere mekanikken i chemotactic migrasjon av mobilnettet kollektiver.

Introduction

Cellular migrasjon i biologiske systemer er et grunnleggende fenomen som er involvert i vevs dannelse, immunresponsen, og sår helbredelse1,2,3. Cellular migrasjon er også en viktig prosess i enkelte sykdommer som kreft4. Celler overføres ofte som en gruppe i stedet for enkeltvis, som kalles kollektiv celle migrering4,5. For celler til å flytte kollektivt, sensing av mikromiljøet er viktig6. For eksempel celler oppfatter fysikalsk stimuli og svare ved å endre motilitet, celle-substrat interaksjoner, og celle-celle interaksjoner, noe som resulterer i retningsbestemt migrasjon langs en kjemisk gradient7,8, 9,10. Basert på denne forbindelsen, har raske fremskritt blitt gjort i Lab-on-a-chip teknologier som kan skape godt kontrollerte kjemiske microenvironments som gradient av en chemoattractant11,12,13 . Stund disse laboratorium-opp på-en-flis-basert materialer ha tidligere blitt pleide studere chemotaxis av det cellular ensemble eller cellular spheroids14,15,16,17, de har vært brukt hovedsakelig i sammenheng med single-celle migrasjon18,19,20,21. Mekanismer underliggende en cellulær kollektiv reaksjon på en kjemisk gradient er fortsatt ikke godt forstått14,22,23,24,25,26 . Dermed vil utviklingen av en plattform som muliggjør spatiotemporal kontroll av løselige faktorer, samt in situ observasjon av cellenes Biofysiske, bidra til å avdekke mekanismene bak kollektiv celle migrasjon.

Utviklet og beskrevet her er et multi-ledet mikrovæskebasert system som muliggjør generering av en konsentrasjon gradient av oppløselige faktorer som modulerer migrasjon av mønstrede celle klynger. I denne studien er hepatocytter vekstfaktor (HGF) valgt til å regulere trekk atferden til Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler. HGF er kjent for å dempe celle-celle integritet og forbedre motilitet av cellene27,28. I mikrovæskebasert systemet, Fourier Transform traction mikroskopi og monolag stress mikroskopi er også innarbeidet, som tillater analyse av motilitet, kontraktile kraft, og intercellulære spenning indusert av konstituerende celler som svar på en HGF Gradering. Innenfor samme øy, celler som ligger nær høyere konsentrasjon av HGF migrere raskere og vise lavere intercellulære stress nivåer enn de på siden med lavere HGF konsentrasjon. Resultatene tyder på at denne nye eksperimentelle systemet er egnet til å utforske andre spørsmål i felt som involverer kollektive cellulære migrasjon under kjemiske graderinger av ulike oppløselige faktorer.

Protocol

Merk: litografi av SU-8 muggsopp for sjablonger (tykkelse = 250 μm) og MicroChannel deler (tykkelse = 150 μm), glass etsing (dybde = 100 μm), og støpt fabrikasjon ble outsourcet ved å sende design ved hjelp av dataassistert designprogramvare til produsenter. 1. fabrikasjon av Polydimethylsiloxan (PDMS) sjablong og MicroChannel Design Micropattern av sjablongen og MicroChannel. Dikte eller outsource SU-8 muggsopp (tykkelse på ~ 250 μm for sjablonger og ~ 150 μm for m…

Representative Results

For å utforske kollektiv migrasjon under en kjemisk gradient, ble et mikrovæskebasert system integrert med trekkraft mikroskopi (figur 1). Å bygge det integrerte systemet, polyakrylamid (PA) gel ble støpt på tilpasset cut glass, og MDCK celler ble sådd innenfor micropatterned øyer laget av en PDMS sjablong. For dette eksperimentet ble tolv øyer av MDCK celler (fire rader av tre kolonner, diameter på ~ 700 μm) opprettet. Etter celler knyttet til PA gels, ble PDMS sjablongen fjernet …

Discussion

Kollektiv migrasjon av konstituerende celler er en viktig prosess under utvikling og regenerering, og migrerer retningen er ofte guidet av kjemisk gradient av vekstfaktorer4,23. Under kollektiv migrasjon, celler holde samspill med nærliggende celler og underliggende underlag. Slike mekaniske interaksjoner gir opphav til emergent fenomener som durotaxis42, plithotaxis33, og kenotaxis43. Imidl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av den koreanske regjeringen (MSIP) (nr. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant, og BK 21 Plus-programmet. Det ble også støttet av National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

Materials

0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 041918 (2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Tags

Traction MicroscopyMicrofluidicsCollective Cell MigrationBiochemical GradientCellular ForcesPDMSSU-8 MoldGlass Slide SilanizationPolyacrylamide Gel

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image