Denna metod beskriver användningen av R26R-Confetti (Confetti) musmodell för att studera mineraliserade vävnader, som täcker alla steg från avel strategi till bilden acquirements. Inkluderat är ett allmänt protokoll som kan appliceras på alla mjuka vävnader och ett modifierat protokoll som kan appliceras på mineraliserade vävnader.
Märkning en enskild cell i kroppen för att övervaka vilka celltyper det kan ge upphov till och spåra dess migration genom organismen eller bestämma dess livslängd kan vara ett kraftfullt sätt att avslöja mekanismer för vävnad utveckling och underhåll. En av de viktigaste verktyg som för närvarande finns för att övervaka celler in vivo är Confetti musmodell. Konfetti-modellen kan användas för att genetiskt märka enskilda celler i levande möss med olika fluorescerande proteiner i ett cell typspecifikt sätt och övervaka deras öde, liksom ödet för deras avkomma över tiden, i en process som kallas klonsk genetisk spårning eller klonala linjen spårning. Denna modell har genererats för nästan ett decennium sedan och har bidragit till en förbättrad förståelse för många biologiska processer, särskilt relaterade till stamcellsbiologi, utveckling och förnyelse av vuxna vävnader. Men att bevara den fluorescerande signalen tills Bildinsamling och samtidig upptagning av olika fluorescerande signaler är tekniskt utmanande, särskilt för mineraliserad vävnad. Denna publikation beskriver ett steg-för-steg-protokoll för att använda Confetti-modellen för att analysera brosk av odlings plåt som kan appliceras på alla mineraliserade eller nonmineraliserade vävnader.
Förbättrade metoder för att övervaka cellens beteende är önskvärt att öka experimentell effektivitet när man använder djurmodeller. En av de mest informativa metoder för att övervaka cellens beteende i vivo är klonala linjen spårning med Multicolor reporter mus stammar1, inklusive den utbredda R26R-konfetti (konfetti) mus2. Genom att genetiskt märka enskilda celler med fluorescerande proteiner och följa dessa celler över tid har forskare inom många områden använt konfetti-musen för att avslöja insikter i en mängd olika biologiska system.
Den Confetti Mouse är en loxP-baserade reporter system där CRE beroende DNA rekombination orsakar det permanenta uttrycket av en av flera möjliga fluorescerande proteiner i en stokastisk sätt2. Den R26R-Confetti allel innehåller ubiquitously uttryckt cagg promotor, som ligger omedelbart uppströms en loxP-flankerad NeoR-kassett2, vars polyadenylation sekvens avslutar transkription3, följt av Brainbow 2,1 konstruera4. Därav, CRE-medierad rekombination samtidigt exciserar NeoR-kassett och leder till produktion av vissa fluorescerande proteiner beroende på vilka delar av brainbow 2,1 konstruera är excised. Den här funktionen gör Confetti Mouse extremt anpassningsbar eftersom den kan användas för att rikta någon cellulär population i en mus för vilken en specifik CRE-stam finns tillgänglig. Passage av en vävnad-specifika CRE stam med R26R-konfetti stammen ger specificiteten av märkning. Emellertid, den CRE stammen bör också vara inducerbara (t. ex., CreERT eller CreERT2, som kräver tamoxifen bindning så att de kan komma in i kärnan och inducera DNA rekombination5) så att märkning kan uppnås vid angivna tidpunkter. Således kan en cellulär population märkas genom att injicera den resulterande CreERT-positiva/konfetti-positiva avkomma med tamoxifen vid önskad tidpunkt och spåras till en viss ålder, när vävnaderna av intresse kan samlas in för analys. Efter vävnads bearbetningen kan de fluorescerande cellerna direkt visualiseras genom konfokalmikroskopi så att avkomman från varje initialt märkt cell kan separeras från avkomman som genereras av någon annan märkt cell baserat på deras specifika fluorescerande på så sätt att klonaliteten kan bedömas (dvs. klon genetisk spårning).
På grund av konfettimodellens flexibilitet har det tillämpats för att studera utveckling och underhåll av många olika vävnader i hälsa och sjukdom2,6,7,8,9, 10,11. Ett vanligt sätt att använda modellen är att märka en viss population av celler och bestämma vilka vävnader de (och/eller deras avkomma) har bidragit till. En sådan slutsats att använda denna metod var att den vuxna tanden består av celler med en gliaceller ursprung6. En annan tillämpning av modellen är att studera stamcells homeostas. Konfetti-modellen avslöjade till exempel att stamcells nischer i tarm krypterna gradvis blir monoklonala eftersom vissa stamceller kloner dominerar underKonkurrensen mellan stamceller2. Modellen kan också användas för att bedöma cellproliferation, vilket är särskilt användbart för att studera långsamt skiljande celler. Till exempel, klon bildning i ledbrosk12 bedömdes, och de kortsiktiga effekterna av en igelkott antagonist på tillväxtplattan kondrocyter i fem veckor gamla möss studerades13.
Trots den relativa enkelheten i konfetti-modellen, kan den fluorescerande signalen vara tekniskt utmanande att bevara tills bild insamlingen, särskilt när man analyserar mineraliserade vävnader. Här beskriver protokollet en optimerad modell för att använda konfetti-musen med postnatal ben (upp till 6 månaders ålder), vilket gör det möjligt för fluorescerande proteiner att direkt visualiseras av konfokalmikroskopi utan behov av immunodetection. Detta förenklade protokoll kan appliceras på nonmineraliserade vävnader. Dessutom ingår en beskrivning av hur proverna ska förvaras för att bevara den fluorescerande signalen under en längre tid av minst 3 år. En översikt över protokollet presenteras i figur 1.
Confetti-modellen användes flitigt för att studera mineraliserade broskvävnader12,13,14 och för att beskriva det optimerade protokollet. Konfetti möss2 med en kopia eller två kopior av R26R-Confetti allel kan användas för avel och experiment. Rekombination hos möss med en allel av Brainbow 2,1 konstruera kommer att ge fyra potentiella etiketter: rött fluorescerande protein (RFP, cytoplasmiska), gult fluorescerande protein (YFP, cytoplasmiska), cyan fluorescerande protein (CFP, membran-lokaliserad), och grön fluorescerande protein (GFP, Nucleus-lokaliserad), medan rekombination i homozygot konfetti möss (dvs, som innehåller två kopior av Brainbow 2,1 konstruera) kommer att ge 10 möjliga färg utgångar (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + CFP, RFP + GFP, YFP + YFP, YFP + CFP, YFP + GFP, CFP OCH CFP, GFP + GFP). Men eftersom DNA-excision och inversion händelser inträffar i en stokastisk sätt, rekombination för att producera GFP förekommer i endast en liten del av celler, som tidigare rapporterats2, och till synes skiljer sig från cell-typ eller CRE linje används2, 12,13. Därför, med tanke på den låga förekomsten av rekombination händelser som leder till GFP uttrycket, sex färg utgångar är de vanligaste i homozygot konfetti möss.
Ett viktigt övervägande när man planerar experiment med konfetti mus är att hitta en lämplig CRE stam. Först, eftersom Confetti allel har flera loxP platser, en rekombination händelse utesluter inte en andra4. Detta innebär att om en cell är märkt och delar för att producera en klon av en färg, en andra rekombination händelse i en av dess dotterceller skulle generera en annan färg, vilket döljer den sanna klon expansionen. Sålunda, noninducible CRE stammar, där enzymet är alltid aktiv om motsvarande Promotorn är aktiv, är inte tillrådligt. För det andra, i vissa stammar uttrycket av CRE driver ofta kommer på bekostnad av ett endogent protein, vilket skapar en fenotyp av sin egen (t. ex. för Prg4-GFPCreERT2 Knock-in mus stam där möss Harbor två CRE alleler15), så en enda kopia av CRE allel är önskvärt. I alla beskrivna experiment, en enda kopia av Col2CreERT16 bars av antingen hanen eller den kvinnliga föräldern att generera Col2CreERT: konfetti möss, som beskrivs13. Vidare är specificiteten hos CRE-linjen till celltypen av intresse en viktig faktor. Till exempel, Col2CreERT är Chondrocyte-specifika, men etiketter flera distinkta populationer av chondrocyter i tidigt postnatal brosk17. Slutligen kan aktiviteten hos olika CRE-stammar förändras avsevärt med djur åldern, eftersom Promotorns endogena aktivitet utnyttjas för förändringar i CRE-uttrycket, även i celler av samma typ (t. ex. Prg4-GFPCreERT2, som kan kräva en ökad antal tamoxifen doser för att märka ytliga zon celler som möss15år).
Antalet märkta celler kommer att återspeglas av mängden tamoxifen ges, så det är inte alltid önskvärt att ge den maximala dosen eftersom särskiljande kloner från varandra kan vara svårt. Eftersom CRE uttrycket kommer att variera under regleringen av olika initiativtagare samt med åldern, den tamoxifen doseringen måste justeras för att optimera märkning. Det är viktigt att notera att cellerna inte är omedelbart fluorescerande på utlösande rekombination eftersom tiden krävs för att rekombinationen ska inträffa och de resulterande fluorescerande proteiner att ackumuleras tillräckligt för avbildning. Ett brett spektrum av timmar (mellan 24 − 72 h) behövs, vilket verkar påverkas av CRE linje, cell-typ, och djur ålder. Eftersom tamoxifen kan vara biologiskt aktiv långt efter administrering18 det är alltid tillrådligt att grundligt kontrollera rekombination effektivitet i varje modell.
Under den konfokala mikroskopi steg, excitation av konfetti fluorescerande proteiner kräver penetration av vävnaden med laserljus. Eftersom olika vävnader har olika egenskaper, laserljus kan inte tränga 160 μm tjocka delar av alla vävnader. Sådana tjocka sektioner kan dock användas för brosk av odlings plåt, som används i figur 2, figur 3. Observera att varje Mikroskop är olika, och det är osannolikt att de beskrivna inställningarna (kompletterande fil 1) kommer att fungera perfekt utan smärre justeringar. En av de största utmaningarna är att särskilja de olika fluorescerande proteinerna för att säkerställa att det inte finns någon förorening från en kanal till en annan. Till exempel signalen i YFP-kanalen som orsakas av fluorescensen från GFP överlappar mellan YFP-och RFP-kanalerna. YFP-och CFP-kanalerna måste också kontrolleras noggrant. Detta kan göras på flera sätt. För det första kan utsläpps området för fluorescerande ljusvåglängder som registreras för varje fluorescerande protein begränsas. För det andra kan du optimera signalen genom att justera lasereffekten i kombination med den digitala förstärkningen. I denna studie var dessa steg tillräckliga, men de förlitar sig på en stark fluorescerande signal. Detta innebär att ineffektiv vävnads bearbetning i teorin kan minska aktiviteten hos fluorescerande proteiner, eller en svag laserljus källa kan försämra kanalseparation.
En av fördelarna med Confetti Mouse är att den kan kombineras med ett stort antal genetiskt muterade stammar som finns tillgängliga så att effekten av specifika gener på klonala dynamik kan studeras10,11,12 ,13,14,19,20, om än med vissa begränsningar. Till exempel kan rekombination av konfetti alleler och genen av intresse inte separeras när du använder CRE loxP-baserade mutanter kombinerat med klonala Lineage spårning. Icke desto mindre kan en sådan sammanblandning av återkombinationshändelser vara effektiv10,14,20. Till exempel, denna möjlighet användes för att utforska det ökade cellnumret i vilo zonen av möss efter postnatal Chondrocyte-specifik ablation av TSC1 i tillväxtplattan21 och avslöjade den klonala relationen mellan dessa celler över tid 13. Dessutom kan den vävnads-specifika klon analysen med konfetti-möss användas med icke-CRE loxP-baserade muterade möss11, och det är också möjligt att kombinera dessa metoder med farmakologiska8,9 ,13 och/eller kirurgiska modeller8 för att visualisera klonala svar på andra funktionella perturbations. Ytterligare möjligheter uppstår när man kombinerar konfetti märkta sektioner med immunodetection av endogena proteiner genom immunofluorescens. En sådan analys gör det möjligt att identifiera spårade celler och deras samlokalisering med en känd markör. Med den fixeringsmetod som beskrivs häri är det möjligt att genomföra immunofluorescens och ändå visualisera fluorescensen från konfetti fluorescerande proteiner12,13. I de nämnda tidningarna krävdes dock inte antigen hämtning. Stränga antigen hämtnings metoder, såsom kokning i citratbuffert, leder till en fullständig förlust av konfetti fluorescens. Även om konfetti fluorescerande proteiner kan sedan upptäckas med hjälp av antikroppar22, en förlust av klonala identitet kan inträffa.
Sammanfattnings, med hjälp av Confetti modellen till etikettceller in vivo är ett informativt verktyg för att analysera ödet för dessa celler över tiden. Den beskrivna metoden ger ett snabbt och effektivt sätt att direkt visualisera fluorescerande proteinuttryck i mineraliserade vävnader.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Evgeny Ivashkin för metodologisk rådgivning. Detta arbete stöddes ekonomiskt av Vetenskapsrådet (A. S. C), den ryska vetenskapliga stiftelsen (Grant #19-15-00241 till ASC), Karolinska Institutet (född), StratRegen KI och stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-årsfond (född), Stiftelsen Frimurare barnhuset och sallskapet Barnavard (P.T.N.), kinesiskt Stipendieråd (B.Z.). Det konfokala mikroskopet finansierades av Knut och Alice Wallenbergs stiftelse.
2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Corn oil | Sigma | C8267 | |
Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
OCT | Sakura | 102094-104 | |
Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
PBS | Gibco | 14200075 | |
Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |