Denne protokollen gjør det mulig for optimalisering og påfølgende effektiv generering av kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner fra primære kroniske lymfatisk leukemi celler. Disse prøvene brukes til å bestemme protein lokalisering samt endringer i protein smugling som finner sted mellom de kjernefysiske og cytoplasmatiske rom på celle stimulering og narkotikabehandling.
Kjernefysisk eksport av makromolekyler er ofte deregulerte i kreftceller. Tumor Suppressor proteiner, slik som p53, kan gjengis inaktive på grunn av avvikende mobilnettet lokalisering forstyrre deres virkningsmekanisme. Overlevelse av kronisk lymfatisk leukemi (CLL) celler, blant andre kreftceller, er assistert av dereguleringen av kjernefysiske til cytoplasmatiske skytteltrafikk, i hvert fall delvis gjennom dereguleringen av transport reseptor XPO1 og konstituerende aktivering av PI3K-mediert signal veier. Det er viktig å forstå rollen til individuelle proteiner i sammenheng med deres intracellulære plassering for å få en dypere forståelse av rollen til slike proteiner i pathobiology av sykdommen. Videre, identifisere prosesser som ligger til grunn celle stimulering og virkningsmekanismen av spesifikke farmakologiske hemmere, i sammenheng med subcellulære protein smugling, vil gi en mer helhetlig forståelse av mekanismen av Handling. Protokollen er beskrevet her muliggjør optimalisering og påfølgende effektiv generering av kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner fra primære kroniske lymfatisk leukemi celler. Disse fraksjonene kan brukes til å bestemme endringer i protein smugling mellom kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner på celle stimulering og narkotikabehandling. Dataene kan bli kvantifisert og presentert parallelt med immunofluorescent bilder, og dermed gi robuste og målbare data.
Transport av makromolekyler mellom kjernen og cytoplasma har lenge vært etablert for å spille en nøkkelrolle i normal cellulære funksjon og er ofte deregulerte i kreftceller1,2. Slike dereguleringen kan skyldes overuttrykte/mutasjon av proteiner som kontrollerer kjernefysisk eksport. Et slikt protein Exportin-1 (XPO1), er en transport reseptor som eksporterer > 200 kjernefysisk eksport signal (NES)-inneholder proteiner inn i cytoplasma fra nucleus2. XPO1-cargos inkluderer p53, FOXO familiemedlemmer og IB, bidrar til deres deaktivering ved å hemme deres mekanisme av action1,2,3. Ytterligere protein mislocalization kan oppstå når microenvironmental signaler impinge på kreftceller, som fører til aktivering av intracellulære signalering trasé som fosfatidyl-Inositol-3-kinase (PI3K)/akt Pathway, noe som resulterer i Deaktivering av FOXO familiemedlemmer og påfølgende eksport fra nucleus4,5. Slike mislocalization av tumor Suppressor proteiner har vært innblandet i utviklingen av en rekke hematologiske og solide svulster1,2,6.
Utviklingen av små molekyl hemmere for klinisk bruk i hematologiske ondartet (akutt myelogen leukemi (AML)/CLL), som binder seg til og selektivt hemme XPO1 funksjon, understreker viktigheten av å utvikle egnede teknikker for å ta opp virkningen av farmakologiske midler på skytteltrafikk av proteiner mellom kjernefysiske og cytoplasmatiske rom6,7,8. Imaging teknikker har avansert betydelig muliggjør identifisering av proteiner i subcellulære rom ved ekstern stimulering av narkotika behandlinger, men viktigheten av robuste og støttende parallelle teknikker er avgjørende for pålitelig informere et vitenskapelig publikum om gyldigheten av et resultat.
Hvile lymfocytter og ondartede CLL-B celler isolert fra pasientens blodprøver representerer en utfordring i generering av kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner på grunn av den høye kjernefysiske: cytoplasmatiske ratio. Optimalisering av eksperimentelle forhold for å generere robuste og pålitelige eksperimentelle data er selvsagt kritisk for å planlegge fremtidige eksperimentelle programmer. Metoden beskrevet her muliggjør kvantifisering av proteiner i kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner og bestemmer hvordan disse proteinene kan bli påvirket av cellulær stimulering og/eller narkotikabehandling.
Protokollen beskrevet gir en rask og effektiv metode for generering av kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner fra primære CLL celler, og påfølgende kvantifisering av protein smugling mellom kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner på celle stimulering og narkotikabehandling. Dataene som presenteres demonstrerer evnen til å oppdage smugling av spesifikke proteiner, for eksempel FOXO1, mellom kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner, ved behandling med en dobbel mTOR-hemmer AZD8055 i nærvær/fravær av BCR Cross Linking gjennom F ( AB ‘)2 fragment stimulering (Figur 3 og Figur 4). Kopling disse eksperimentene med kvantifisering av vestlige blots fra individuelle CLL pasientprøver, muliggjør objektive analyser av data generert og demonstrerer robusthet av analysen som er beskrevet for å kvantifisere globale endringer i protein lokalisering i CLL celler isolert fra pasient kohorter (Figur 4). Det er klart fra data som et gjennomsnitt på fem pasientprøver i cytoplasmatiske fraksjoner nådde nær betydning. Gitt den kliniske heterogenitet av CLL pasienter11, ville disse analysene vanligvis utføres på større pasient kohorter, og/eller fokusert på bestemte Prognostisk undergrupper av pasientene for å få en fyldigere forståelse av den cellulære RESPONSEN til CLL celler til spesifikke medikament behandlinger.
Dataene som presenteres demonstrerer viktigheten av å velge protein markører som utelukkende bor i enten cytoplasmatiske eller kjernefysiske fraksjoner, som renheten av fraksjonering vil bli bekreftet av disse markørene. β-tubulin ble valgt for cytoplasmatiske brøk bekreftelse, og Lamin A/C som en kjernefysisk markør. Ytterligere proteiner som vanligvis brukes er GAPDH og α-tubulin for å identifisere cytoplasmatiske fraksjon eller Brg1 (SMARCA4), TFIID og RNA polymerase II for kjernefysisk brøk renhet4,5. Det må imidlertid utvises forsiktighet ved valg av proteiner som er svært beriket med bestemte fraksjoner, og som ikke finnes i begge fraksjoner (f.eks. γ-tubulin) (figur 2C)9. Faktisk, GAPDH og utgangen mens generelt anses å være cytoplasmatiske proteiner kan lokalisere til kjernen12,13, fremhever viktigheten av å velge en brøk markør som ikke flytte når stimulering eller behandling er brukt på cellene. Videre er det viktig å bekrefte at protein markør valgt uttrykkes i cellen av interesse ved å kjøre WCL sammen med subcellulære fraksjoneringer.
I det representative eksperimentet som vises, ble det samme antall CLL-celler brukt for hver tilstand (stimulering/legemiddelbehandling), og deretter ble de fraksjonering prøvene klargjort umiddelbart. Innlasting av 10 mikrogram fraksjonert protein/kjørefelt gir tilstrekkelig materiale for påvisning av proteiner av interesse. Ettersom disse prøvene bare gjennomgikk en kortsiktig behandling og stimulering (opp til 4 h), ble det antatt at protein nivået ville forbli det samme i hver prøve, og et protein analysen ble ikke utført. Men hvis celle behandlinger er utvidet (18-72 h), kan nivået av celle død eller spredning i cellene betydelig endre kvaliteten og mengden av protein ekstrahert, avhengig av narkotika/celle stimulering brukt, og dermed endre protein nivået i den behandlede /stimulated prøver. I disse tilfellene for lengre sikt narkotika behandlinger, er det tilrådelig å utføre protein kvantifisering ved hjelp av en Bradford analysen eller tilsvarende, før vestlige blotting å sikre samme mengde protein kjøres i hvert kjørefelt av immunoblot. Tilstedeværelsen av vaskemidler kan forstyrre spesifikke protein analyser14, kan denne forstyrrelsen reduseres ved å fortynne celle brøk protein prøver. I tillegg, bruk den komplette lyseringsbufferen som blank, med samme fortynning som i prøvene som testes.
For å gi støtte bevis for funnene beskrevet her, kan parallelle eksperimenter utføres ved hjelp av fluorescens mikroskopi å analysere plasseringen av FOXO1 innen CLL celler for å muliggjøre visualisering av disse funnene5. Videre kan subcellulære fraksjoner generert også brukes for enzym aktivitet analyser eller Proteomikk analyse i ytterligere nedstrøms analyser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Natasha Malik for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Denne studien ble finansiert av en Bloodwise prosjekt stipend tildelt AMM (18003). FACS analyse anlegg ble finansiert av Howat Foundation. MWM ble finansiert av en PhD-studentship fra Friends of Paul O ‘ Gorman leukemi Research Centre, JC ble finansiert av Friends of Paul O ‘ Gorman leukemi Research Centre og JH ble finansiert av en Bloodwise prosjekt stipend (18003).
1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
DMSO | Sigma | D2650 | |
EDTA | Sigma | EDS | |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
HyperPAGE 10 – 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge |