इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके कार्डियक फ़ंक्शन के निष्कर्षण और मूल्यांकन की तकनीक का कदम-दर-कदम वर्णन करना है। यह पद्धति छोटे जमे हुए बायोप्सी का उपयोग करके माओफ्लामेंट फ़ंक्शन के माप और तीव्र मॉड्यूलेशन की अनुमति देती है जिसे चूहों से पुरुषों तक विभिन्न हृदय स्थानों से एकत्र किया जा सकता है।
इस लेख में, हम एक ही परिग्रह (“चमड़ी”) कार्डियोमायोसाइट को अलग करने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करते हैं और इसे कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए एक बल-मापने वाले उपकरण और एक मोटर से जोड़ते हैं। इन अध्ययनों से कार्डियोमायोसाइट कठोरता (निष्क्रिय बल) और विभिन्न कैल्शियम (सीए2 +)के साथ इसकी सक्रियता की अनुमति मिलेगी- जिसमें अन्य लोगों के बीच निर्धारित करने के लिए समाधान शामिल हैं: अधिकतम बल विकास, माइलोफिलमेंट सीए2 +-संवेदनशीलता (पीसीए50),सहयोगशीलता (एनहिल) और बल पुनर्विकास की दर (केटीआर)। यह विधि कार्डियोमायोसाइट्स के सक्रिय और निष्क्रिय दोनों गुणों पर सीधे माइसोफिलामेंट्स और एक्सोजेनस रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर काम करने वाली दवाओं के प्रभावों के निर्धारण को भी सक्षम बनाती है। चिकित्सकीय रूप से, चमड़ी कार्डियोमायोसाइट अध्ययन कई मायोकार्डियल रोगों के रोगविज्ञान को उजागर करते हैं और माइफिलामेंट्स को लक्षित करने वाले चिकित्सीय हस्तक्षेपों के प्रभाव के इन विट्रो मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। कुल मिलाकर, यह तकनीक ओपन हार्ट या ट्रांसप्लांट सर्जरी के दौरान प्राप्त पशु मॉडल और मानव ऊतक में इन विट्रो और वीवो मापदंडों के बीच सहसंबंधों की जांच करके हृदय रोग विज्ञान के स्पष्टीकरण को सक्षम बनाती है।
परंपरागत रूप से, मायोकार्डियल यांत्रिक गुणों का मूल्यांकन ज्यादातर बहुकोशिकीय तैयारी में किया गया है, जैसे कि पेपिलरी मांसपेशियों और ट्राबेकुला1,2। बहुकोशिकीय हृदय की मांसपेशियों स्ट्रिप्स में कोशिकाओं की विषम आबादी शामिल है, जिसमें अभिविन्यास और बल उत्पादन, विद्युत गतिविधि और तनाव/तनाव वितरण के अज्ञात पैटर्न के साथ अनुबंध कार्डियोमायोसाइट्स के साथ-साथ आसपास के कनेक्टिव ऊतक मैट्रिक्स3,4शामिल हैं। कोलेजन के बिना तैयारी और एक ही कार्डियोमायोसाइट युक्त एक बहुत ही सटीक और नियंत्रित तरीके से सारकोमेरे लंबाई और क्रॉस-ब्रिज संकुचन गुणों की माप की अनुमति देगा5,6। इसलिए, पिछले चार दशकों में, कई पद्धतियों को विकसित किया गया था जिससे एक कार्डियोमायोसाइट6,7के यांत्रिक, संकुचन और विश्राम गुणों की जांच की अनुमति मिली। इन कोशिकाओं का अनुबंध कार्य सारकोमेरे लंबाई और क्रॉस-ब्रिज साइकिलिंग काइनेटिक्स3पर दृढ़ता से निर्भर करता है। इस प्रकार, एकल अलग हृदय कोशिकाओं में सीधे मांसपेशियों के कार्य की जांच करना वांछनीय है, यह देखते हुए कि यह सारकोमेरे लंबाई और प्रदर्शन के साथ-साथ क्रॉस-ब्रिज फ़ंक्शन और संकुचन गुणों का आकलन करने की अनुमति देता है। हालांकि , μN स्तर पर बल माप रिकॉर्ड करते समय एक उचित ऑप्टिकल सारकोमेरे संकल्प के साथ कार्यात्मक कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करना और संलग्न करना अभी भी चुनौतीपूर्ण है और3,6विकसित हो रहा है। अन्य चुनौतियां वे लॉजिस्टिक्स हैं जिन्हें कार्डियोमायोसाइट्स को हौसले से एकत्र बायोप्सी से अलग करने के लिए स्थापित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, मानव बायोप्सी संग्रह की अनिश्चितता प्रयोगों की व्यवहार्यता को ख़तरे में डालना हो सकता है।
इसके अलावा, वैज्ञानिक प्रक्रियाओं (3Rs के सिद्धांतों) के लिए पशु प्रयोग के प्रतिस्थापन, कमी और शोधन के बारे में नैतिक चिंताओं ने सेलुलर और ऊतक स्तर पर अध्ययन परिवर्तनों को बढ़ावा दिया है, अधिमानतः मानव बायोप्सी में, या छोटे पशु नमूनों में । वास्तव में जटिलता के छोटे स्तर पर विट्रो में हृदय कार्य का आकलन करने के लिए पद्धतियों का एक प्रगतिशील शोधन पूरे शरीर में परिणामों के उचित एकीकरण की अनुमति देता है और उन्हें नैदानिक परिदृश्य में अनुवाद करता है7. कुल मिलाकर, कार्डियोमायोसाइट्स निकालने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों का उपयोग करना एक आकर्षक विकल्प हो सकता है।
मायोकार्डियल ऊतक को छोटे टुकड़ों में काटा जाता है और मोर्टार और मूसल के साथ समरूप किया जाता है। इस समरूपता का परिणाम चमड़ी बंडल और अलग कोशिकाओं का निलंबन है जिसमें सर्कोलेमल क्षति की अलग-अलग डिग्री होती है, जिसमें मायोप्लाज्म स्नान माध्यम के संपर्क में आता है और सभी सेलुलर घटकों को धोया जाता है। सारकोलेम्मा से आगे दूर होने वाले माइफिब्रिल्स जैसी संरचनाएं संरक्षित हैं। इस प्रकार, मायोफिब्रिलर उपकरण से जुड़े सारकोमेरे छोटा और कार्यात्मक गुणों को अक्षुण्ण रखा जाता है और इसे8,9दर्ज किया जा सकता है।
कार्डियोमायोसाइट फोर्स मेजरमेंट सिस्टम में एक इलेक्ट्रोमैग्नेटिक मोटर होता है, जिसका इस्तेमाल कार्डियोमायोसाइट लंबाई और फोर्स ट्रांसड्यूसर को समायोजित करने के लिए किया जाता है, जो आइसोमेट्रिक कार्डियोमायोसाइट संकुचन को मापता है। एक परमीलित, या चमड़ी, कार्डियोमायोसाइट को एक प्रायोगिक कक्ष में रखा जाता है जिसमें आराम समाधान ([सीए2 +] और लेफ्टिनेंट; 10 एनएम) और सिलिकॉन-2 पतली सुइयों से चिपके हुए हैं: एक मोटर से जुड़ा हुआ है और दूसरा बल ट्रांसड्यूसर से। कार्डियोमायोसाइट आकृति विज्ञान और सारकोमेरे लंबाई निर्धारित करने के लिए एक ऑप्टिकल सिस्टम का उपयोग किया जाता है। प्रायोगिक प्रोटोकॉल में अक्सर विभिन्न सीए2 + सांद्रता वाले बफर समाधानों पर बल रिकॉर्डिंग की एक श्रृंखला होती है, जो ऐक्टिन-मायोसिन क्रॉस-ब्रिज काइनेटिक्स का निर्धारण और पूर्व-परिभाषित सारकोमेरे लंबाई(चित्र 1)पर घुड़सवार कार्डियोमायोसाइट्स के निष्क्रिय तनाव का मापन होता है। तरल नाइट्रोजन में जमे हुए मायोकार्डियल नमूनों से परमीवल कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव (और बाद में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) एक तकनीक है जो अधिकतम सीए2 +-सक्रिय (सक्रिय) बल प्रति क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र (टी-एक्टिव, केएन∙एम-2), सीए2 कोमापने के लिए सेलुलरयांत्रिकीऔर प्रोटीन बायोकेमिस्ट्री का उपयोग करती है। + स्वतंत्र (निष्क्रिय) तनाव (टीनिष्क्रिय,kn∙m-2), myofilaments Ca2 +-संवेदनशीलता (पीसीए50),myofilaments सहयोगशीलता (nHill), बल पुनर्विकास की दर (ktr) के साथ ही टीसक्रिय,टीनिष्क्रिय,पीसीए50,एनहिल और केटीआर की लंबी निर्भरता।
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य विभिन्न प्रजातियों से जमे हुए नमूनों से अलग एकल चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स के कार्यात्मक यांत्रिक गुणों का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय प्रक्रिया के रूप में कार्डियोमायोसाइट फोर्स मेजरमेंट सिस्टम की क्षमता को स्पष्ट और संक्षेप में प्रस्तुत करना है।
चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके कार्डियक फ़ंक्शन का इन विट्रो मूल्यांकन शारीरिक (जैसे, खिंचाव) और पैथोलॉजिकल संदर्भ (जैसे, इस्केमिया) में कार्डियोमायोसाइट स्तर पर होने वाले संशोधनों को स्पष्ट करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है। इस पद्धति के कई फायदे हैं जैसे कि डिफ्रॉस्टेड नमूनों से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स में कार्य का आकलन करने के लिए मायोकार्डियम की न्यूनतम मात्रा की आवश्यकता होती है; प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला (चूहों13,चूहा 1,14, 15,खरगोश16,सुअर17,कुत्ता18,गिनी पिग19 और मानव20)और अटरिया, बाएं और दाएं वेंट्रिकल्स या अवर्णित दिल के एक विशिष्ट क्षेत्र सहित विभिन्न हृदय स्थानों से कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करना। इसके अलावा, यह तकनीक अपने मूल विन्यास में नियामक और अनुबंधित संरचनाओं के कार्य को मापने के दौरान सीए2 + और ऊर्जा (एटीपी) की विशिष्ट सांद्रता देने की अनुमति देती है।
इस तकनीक की सादगी के बावजूद, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। नमूना संग्रह सहित शुरू से ही प्रत्येक चरण की गुणवत्ता की गारंटी देना आवश्यक है। मायोफिलमेंट प्रोटीन21को प्रोटीज के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । इस प्रकार इसके संग्रह के तुरंत बाद तरल नाइट्रोजन में नमूनों को स्टोर करना अनिवार्य है। ताजा नमूने, जो पहले जमे हुए नहीं थे, काफी उच्च बलों का विकास होगा, इसलिए एक ही प्रोटोकॉल में ताजा और जमे हुए नमूनों में किए गए माप को मिलाना उचित नहीं है। दूसरा सबसे महत्वपूर्ण कदम कार्डियोमायोसाइट्स की निष्कर्षण है। इस प्रक्रिया के दौरान, अधिकांश समय बर्फ पर नमूने को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। एक्सट्रेक्शन/परमीलाइजेशन22के दौरान प्रोटीन के क्षरण के जोखिम को कम करने के लिए प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल का उपयोग किया जा सकता है । तीसरे, नमूनों को सटीक स्केलपेल आंदोलनों का उपयोग करके छोटे टुकड़ों में काटा जाना चाहिए क्योंकि हमने कम गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स को नोट किया था जब इस कदम की अवहेलना की गई थी। एक और महत्वपूर्ण कदम कार्डियोमायोसाइट्स को धोना है क्योंकि ट्राइटन को धोने के बीच सही संतुलन होना मुश्किल है (कोशिका को पार करता है लेकिन इसकी अनग्लूइंग को बढ़ावा देता है) और यथासंभव सुपरनैंट में कई कोशिकाओं को रखते हुए। प्रत्येक नमूने, प्रजातियों या प्रोटोकॉल के लिए पहले निकासी और वॉशआउट की संख्या का प्रयास करना महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, हमारे हाथों में, हमने कहा कि ZSF1 मोटापे से ग्रस्त चूहा ऊतक निष्कर्षण एक “फैटी” पहलू है, जो इन कोशिकाओं को ग्लूइंग के दौरान और अधिक फिसलन बना दिया है, लेकिन अधिक मुश्किल को मापने के लिए नहीं है । जिस तरह से हम इस समस्या को दरकिनार करने के लिए और अधिक प्रयोगों प्रदर्शन के लिए पशु प्रति कोशिकाओं की एक उचित संख्या है । इसके अलावा, गोंद के लिए एक अच्छी कोशिका का चयन करना महत्वपूर्ण है, अर्थात् अच्छी स्ट्रेशन और उचित लंबाई के साथ। यदि कार्डियोमायोसाइट में ये विशेषताएं नहीं हैं, तो यह ज्यादातर सुई युक्तियों से अलग हो जाएगा या कोई/कम बल विकसित नहीं करेगा। यह भी कार्डियोमायोसाइट लगाव के लिए सही गोंद का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, चिपकाने के समय और उसकी प्रभावकारिता को ध्यान में रखते हुए सुई के लिए सेल गोंद । हमारे हाथों में, सिलिकॉन गोंद(सामग्री की तालिका)तेजी से (10-15 मिनट) और काफी मजबूत इलाज करता है। अंत में, अंतिम महत्वपूर्ण कदम कोशिका को चिपकाने के बाद कार्डियोमायोसाइट 5 मिनट को सावधानीपूर्वक उठाने से संबंधित है (सेल को कवर्लिपी में चिपकाने से बचने के लिए) और इसे कुओं में ले जाने से पहले (माइक्रोस्कोप चरण द्वारा खींचे जाने के लिए कोशिका से बचने के लिए)। तालिका 7 इस तकनीक से जुड़े समस्या निवारण, इसके अंतर्निहित कारणों और लगातार समस्याओं को दूर करने के लिए संभावित समाधानों का सारांश देती है।
इस विधि की प्रमुख सीमा यह है कि यह माइलोफिलमेंट अनुबंध से संबंधित सभी प्रश्नों का उत्तर नहीं दे सकता है, जैसे कि मायोफिलमेंट कितनी तेजी से सक्रिय/निष्क्रिय हो जाते हैं । वीवो सेटिंग में, झिल्ली डीपोलराइजेशन, इंट्रासेलुलर सीए2 + वृद्धि और मायोफ्लामेंट्स के लिए इसके प्रसार को अनुबंध करने के लिए मायोसाइट्स के लिए होने की आवश्यकता होती है, जबकि चमड़ी कार्डियोमायोसाइट्स सीए2 + फैलन में माइसोफिलामेंट्स के लिए तुरंत होता है जब सेल सीए2 + समाधान में डूब जाता है। सीए2 + प्रसार की यह तेज दर 23 को कमि़ों की सक्रियता/निष्क्रियता विश्लेषण23को पूर्वाग्रह देगी ।
ये प्रयोग विभिन्न कारकों से प्रभावित होते हैं, जिनमें तापमान, समाधान पीएच, यांत्रिक क्षोभ (सुस्त-पुनः खिंचाव बनाम सुस्त) और सेल अटैचमेंट प्रक्रियाएं (पिन टाई बनाम गोंद), ये सभी चर केटीआर के संदर्भ में साहित्य विसंगतियों के लिए लेखांकन और बल4,12में सारकोमरे लंबाई-निर्भर वृद्धि शामिल हैं।
तकनीक की भविष्य की प्रगति में पारियबिलीकृत कार्डियोमायोसाइट्स के बजाय अक्षुण्ण में कार्यात्मक अध्ययन करना शामिल है। इस तकनीक में कार्डियोमायोसाइट्स पर भरोसा करने का नुकसान है हौसले से अलग (पहले जमे हुए नहीं)। एक और महत्वपूर्ण मुद्दा सीधे इस पद्धति से संबंधित नहीं है, लेकिन यह काफी प्रभाव हो सकता है यह नमूना जमे हुए भंडारण की अधिकतम अवधि से संबंधित है । विशेष रूप से, पूरे भंडारण समय में माइलोफिलमेंट क्षरण की डिग्री स्थापित करना अनिवार्य है (यानी, निकाले गए कार्डियोमायोसाइट्स से प्राप्त अच्छी गुणवत्ता वाले कार्यात्मक डेटा को आश्वस्त करने के लिए कितने समय तक जमे हुए नमूनों को संग्रहीत किया जा सकता है)।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ने पुर्तगाली फाउंडेशन फॉर साइंस एंड टेक्नोलॉजी (एफसीटी), यूरोपीय संघ, क्वाड्रो डी रेफरेन्सिया एस्ट्राटेगिको नैसिनल (क्यूआरएन), फंडो यूरोपु डी डेसेवोल्विमेंटो क्षेत्रीय (फेडरर) और प्रोग्रामा ओपेरासिनल फैक्टर्स डी प्रतिस्पर्धी (प्रतिस्पर्धा) को यूआईसी (यूआईडी/आईसी/00051/2013) अनुसंधान इकाई के वित्तपोषण के लिए धन्यवाद दिया । इस परियोजना को एफिलिव 2020 – प्रोग्रामा ऑपरेसिओनल प्रतिस्पर्धी ई इंटरनसिओनलिज़ाकाओ (पीओसीआई), परियोजना DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), पुर्तगाल 2020 साझेदारी समझौते के तहत Norte पुर्तगाल क्षेत्रीय परिचालन कार्यक्रम (NORTE 2020) द्वारा समर्थित के माध्यम से फेडरर द्वारा समर्थित है, यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (ईआरडीएफ) के माध्यम से, परियोजना NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), यूरोपीय संरचनात्मक और निवेश कोष, लिस्बन के क्षेत्रीय परिचालन कार्यक्रम २०२० द्वारा समर्थित । पैट्रिसिया रॉड्रिग्स को एफसीटी (एसएफआरएच/बीडी/96026/2013) द्वारा वित्त पोषित किया गया था और जोआओ अल्मेडा-कोएल्हो को यूनीवर्सिडा डो पोर्टो/एफएमयूपी और एफएसई-फंडो सोशल यूरोपू द्वारा वित्त पोषित किया गया था, NORTE 2020-Programa Operacional क्षेत्रीय क्या Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais) ।
Acetone | Sigma | 34580 | |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) | Sigma | A2383 | |
Calcium carbonate (CaCO3) | Merck | 1.02067.0500 | |
Imidazole | VWR | 24720.157 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) | Merck | 1.05833.0250 | |
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) | Sigma | M1028 | |
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) | Sigma | B9879 | |
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) | Sigma | P7936 | |
Potassium chloride (KCl) | Merck | 1.04936.1000 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Merck | 8.14353.1000 | |
Propionic acid (C3H6O2) | Merck | 8.00605.0500 | |
Silicone Squeeze Tube | Marineland | 31003 | |
Tritiplex (EGTA) | Merck | 1.08435.0025 | |
Triton® X-100 10% | Merck | 648463 | |
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) | Terre Haute Glas-col | ||
Length Controller ( Model 315C-I) | Aurora Scientific | ||
Force Transducer (Model 403 A) | Aurora Scientific | ||
Software ASI 600A | Aurora Scientific | ||
Sotware VSL (Model 900B) | Aurora Scientific | ||
Inverted Microscope (IX51) | Olympus |