Beskrevet er en Proteomikk arbeidsflyt for å identifisere protein interaksjon partnere fra en kjernefysisk subcellulære brøkdel ved hjelp av immunoaffinity berikelse av en gitt protein av interesse og etikett-fri masse massespektrometri. Arbeidsflyten inkluderer subcellulære fraksjonering, immunutfelling, filter hjulpet prøve forberedelser, frakoblet opprydding, masse massespektrometri og en nedstrøms bioinformatikk rørledning.
Immunoaffinity rensing masse massespektrometri (IP-MS) har dukket opp som en robust kvantitativ metode for å identifisere protein-protein interaksjoner. Denne publikasjonen presenterer en komplett interaksjon Proteomikk arbeidsflyt designet for å identifisere lav overflod protein-protein interaksjoner fra kjernen som også kan brukes til andre subcellulære avdelinger. Denne arbeidsflyten inkluderer subcellulære fraksjonering, immunutfelling, prøveklargjøring, frakoblet opprydding, enkelt-shot etikett-fri masse massespektrometri, og nedstrøms beregningsorientert analyse og data visualisering. Vår protokoll er optimalisert for å oppdage compartmentalized, lav overflod interaksjoner som er vanskelig å identifisere fra hele cellen lysater (f. eks, transkripsjon faktor interaksjoner i kjernen) ved immunutfelling av endogene proteiner fra fraksjonert subcellulære rom. Prøven forberedelse rørledningen skissert her gir detaljerte instruksjoner for utarbeidelse av HeLa celle kjernefysisk ekstrakt, immunoaffinity rensing av endogene agn protein, og kvantitative masse massespektrometri analyse. Vi diskuterer også metodisk hensyn for å utføre stor skala immunutfelling i masse massespektrometri interaksjon profilering eksperimenter og gir retningslinjer for evaluering av datakvalitet for å skille sant positivt protein interaksjoner fra ikke-spesifikke samhandlinger. Denne tilnærmingen er demonstrert her ved å undersøke den kjernefysiske interactome av CMGC kinase, DYRK1A, en lav overflod protein kinase med dårlig definerte interaksjoner innenfor kjernen.
Den menneskelige proteom utstillinger enorme strukturelle og biokjemiske mangfold gjennom dannelsen av stabile multisubunit komplekser og forbigående protein-protein interaksjoner. Følgelig er identifisering av samspill partnere for et protein av interesse vanligvis nødvendig i undersøkelser for å løse molekylære mekanisme. Nylige fremskritt i affinitet rensing protokoller og advent av høyoppløselig rask skanning masse massespektrometri instrumentering har aktivert enkel kartlegging av protein interaksjon landskap i en enkelt objektiv eksperiment.
Protein interaksjon protokoller vanligvis ansette utenfor livmoren uttrykks systemer med affinitet-Tagged Fusion konstruerer å identifisere protein interaksjoner uten å kreve høy kvalitet antistoffer erkjenner et protein av interesse1,2. Men epitope kode-baserte metoder har flere ulemper. Fysisk interaksjon med epitope kan føre til påvisning av uspesifisert copurifying proteiner3. I tillegg, fusjon av disse epitope koder til N-eller C-terminal av et protein kan blokkere native protein-protein interaksjoner, eller forstyrre protein folding å fremme ikke-fysiologiske konformasjonen4. Videre, utenfor livmoren uttrykks systemer overekspresjon vanligvis agnet protein ved supraphysiological konsentrasjoner, som kan resultere i identifisering av artifactual protein interaksjoner, spesielt for dosering-sensitive gener5. For å omgå disse problemene, kan endogene agn proteinet bli immunoprecipitated sammen med tilhørende samspill byttedyr proteiner, forutsatt tilgjengeligheten av et høykvalitets antistoff som anerkjenner den innfødte protein.
Forutsatt her er en interaksjon Proteomikk arbeidsflyt for å oppdage kjernefysiske interactome av en endogene protein ved hjelp av CMGC protein kinase DYRK1A som et eksempel. Forstyrrelse av DYRK1A kopierings nummer, aktivitetsnivå eller uttrykk kan forårsake alvorlig intellektuell uførhet hos mennesker, og embryonale dødelighet i mus6,7,8,9. DYRK1A utstillinger dynamisk spatiotemporal regulering10, og compartmentalized protein interaksjoner11,12, som krever tilnærminger i stand til å oppdage lav overflod interaksjon partnere spesifikke for ulike subcellulære rom.
Denne protokollen sysselsetter mobilnettet fraksjonering av menneskelig HeLa celler til stoffer og nucleoplasm fraksjoner, immunutfelling, prøve forberedelser for masse massespektrometri, og en oversikt over en Bioinformatic rørledning for å evaluere datakvalitet og visualisere resultater, med R-skript som er gitt for analyse og visualisering (figur 1). Proteomikk programvarepakker som brukes i denne arbeidsflyten er alle fritt tilgjengelig for nedlasting eller kan nås via et webgrensesnitt. For ytterligere informasjon om programvare og beregningsorientert metoder, grundig opplæring og instruksjon er tilgjengelig på linkene som er oppgitt.
Den Proteomikk arbeidsflyten som er skissert her, gir en effektiv metode for å identifisere protein interaktører med høy tillit for et protein av interesse. Denne tilnærmingen reduserer utvalgs kompleksiteten gjennom subcellulære brøkdel og fokuserer på å øke identifikasjons samarbeidspartnerne gjennom robust prøve forberedelser, frakoblet prøve opprydding og streng kvalitetskontroll av LC-MS-systemet. Den nedstrøms dataanalyse beskrevet her gir mulighet for en enkel statistisk evaluering av proteiner identifisert som copurifying med agn. Men på grunn av et høyt antall eksperimentelle variabler (skala, cellelinje, antistoff valg), krever hvert eksperiment ulike cutoffs og betraktninger om data visualisering og berikelse.
Den første design vurdering i et IP-MS eksperiment er utvalget av antistoffer som vil bli brukt til copurification av protein av interesse sammen med sine samarbeidspartnere. Mens tilgjengeligheten av kommersielle antistoffer har ekspandert til å dekke større deler av den menneskelige proteom de siste ti årene, er det fortsatt mange proteiner som reagenser er begrenset. I tillegg kan antistoffer som har blitt validert for applikasjoner som Western Blot deteksjon, være ute av stand til selektiv berikelse av mål proteinet i et immunutfelling eksperiment. Før gjennomføre en storstilt interaksjon Proteomikk eksperiment, er det foreslått å fullføre en IP fra en 90% confluent 10 cm parabol, eller tilsvarende celle nummer, og sonde for målet protein av interesse av vestlige blotting. Hvis mer enn ett enkelt antistoff er tilgjengelig for immunutfelling, foreslås det i tillegg å velge flere antistoffer som gjenkjenner epitopes i ulike deler av proteinet. Bindingen av et antistoff til et agn protein kan tette det nødvendige bindings grensesnittet for antatte samarbeidspartnere. Valg av en sekundær epitope for agn proteinet vil øke dekningen av samspillet profilen identifisert av et masse massespektrometri-basert eksperiment.
En annen viktig faktor ligger i valg av den aktuelle kontrollen for å skille høy tillit interaksjoner fra lav-tillit eller uspesifisert interaksjoner fra de som er identifisert som copurifying med agn. Den strengeste kontrollen for et IP-MS-eksperiment er å fullføre immunutfelling fra en CRISPR KO-cellelinje på agnet. En slik kontroll gjør det mulig å identifisere og filtrere ut av ikke-spesifikke proteiner som binder seg direkte til antistoff i stedet for agn proteinet. I tilfeller der det ikke er mulig å generere en CRISPR KO-cellelinje for hvert agn protein, kan en IgG-perle kontroll av den samme isotype av agn-antistoff brukes. I eksperimenter ansette et panel av antistoffer som representerer flere arter, bruk av en perle bare kontroll kan være hensiktsmessig, men vil øke frekvensen av falske positiver identifisert som høy tillit interaktører.
Valg av cellelinjen som brukes i et IP-MS-eksperiment, er avhengig av flere nøkkelfaktorer. Protein uttrykk og lokalisering er i stor grad avhengig av celle type. Mens RNA uttrykket anslag kan bli funnet for de fleste gener i mange brukte cellelinjer, protein uttrykk er dårlig korrelert med RNA uttrykk og må fastsettes eksperimentelt25. Cellelinjer der et agn protein uttrykkes i svært lav kopi nummer bør unngås for å omgå problemer forbundet med drastiske økninger i celle kulturen skala som kan være nødvendig. Det bør bemerkes, men at prøven preparatet kan optimaliseres for påvisning av svært lav overflod proteiner. Den filter hjulpet sample prep (FASP) metoden, mens robust, kan føre til en mer enn 50% tap av peptid i en prøve. Den single-Pot solid-fase-forbedret sample Preparation (SP3) er en effektiv metode for å generere prøver for masse massespektrometri analyse som minimerer prøve tap26. Det forhøyet det å bli frisk satt i stand til av det SP3 metoden av eksemplar forberedelse kan en nyttig alternativ i denne arbeidsstyrke for kvantifisering av protein det falle like ved grensen av oppdagelsen.
Denne Proteomikk arbeidsflyten har blitt brukt på tvers av mange kjernefysiske agn, inkludert kinaser, E3 ubiquitin ligases, og stillas medlemmer av multisubunit komplekser. Hvis du antar at riktig validering av antistoff reagenser, vil en vellykket utførelse av denne arbeidsflyten føre til at protein samarbeidspartnere med høy tillit til proteiner er av interesse.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Grand Challenge Grant til W.M.O. fra Linda Crnic Institute for Down syndrom og av en DARPA samarbeidsavtale 13-34-RTA-FP-007. Vi vil gjerne takke Jesse Kurland og Kira Cozzolino for deres bidrag i å lese og kommentere manuskriptet.
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561096 | |
acetone (HPLC) | Thermo Fisher Scientific | A949SK-4 | |
Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column | Millipore Sigma | UFC503096 | |
Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | |
benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
Dialysis tubing closure | Caroline Biological Supply Company | 684239 | |
DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47724 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 887845 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
HeLa QC tryptic digest | Pierce | 88329 | |
HEPES | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
KONTES Dounce homogenizer 7 ml | VWR | KT885300-0007 | |
Large Clearance pestle 7ml | VWR | KT885301-0007 | |
Lysyl endopeptidase C | VWR | 125-05061 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
Microcystin | enzo life sciences | ALX-350-012-C100 | |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma-Aldrich | 98379 | |
p84 antibody | GeneTex | GTX70220 | |
Phosphate Buffered Saline | |||
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Pierce BSA Protein Digest, MS grade | Thermo Fisher Scientific | 88341 | LCMS QC |
Pierce C18 spin columns | Thermo Fisher Scientific | PI-89873 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | For mass spectrometry sample prep |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0780-01 | |
Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0618-01 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Silica emitter tip | Pico TIP | FS360-20-10 | |
Small Clearance pestle 7ml | VWR | KT885302-0007 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | |
Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing | Thomas Scientific | 3787K17 | |
TC Dish 150, Standard | Sarstedt | 83.3903 | Tissue culture dish for adherent cells |
TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
TCEP | Thermo Scientific | PG82080 | |
TFA | Thermo Fisher Scientific | 28904 | |
Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS | Thermo Fisher Scientific | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
Urea | Thermo Fisher Scientific | 29700 | |
Waters ACQUITY M-Class UPLC | Waters | ||
Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) | Waters | 186007484 | nanoflow C18 column |