Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Islmnprenatal :GFP Ratones transgénicos
Summary
Este trabajo presenta un protocolo para producir cultivos celulares homogéneos de neuronas motoras primarias oculomotoras, trocleas y espinales. Estos cultivos se pueden utilizar para análisis comparativos de las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras oculares y espinales.
Abstract
Las neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas trocleares (CN4) exhiben una notable resistencia a enfermedades degenerativas de las neuronas motoras como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en comparación con las neuronas motoras espinales (SMN). La capacidad de aislar y cultivar CN3 de ratón primario, CN4 y SMN proporcionaría un enfoque para estudiar los mecanismos subyacentes a esta vulnerabilidad selectiva. Hasta la fecha, la mayoría de los protocolos utilizan cultivos celulares heterogéneos, que pueden confundir la interpretación de los resultados experimentales. Para minimizar los problemas asociados con las poblaciones de células mixtas, los cultivos puros son indispensables. Aquí, el primer protocolo describe en detalle cómo purificar y cultivar eficientemente CN3s/CN4s junto con contrapartes SMN de los mismos embriones utilizando embrionarios día 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgénicos embriones de ratón. El protocolo proporciona detalles sobre la disección y disociación tisular, el aislamiento celular basado en FACS y el cultivo in vitro de células de núcleos CN3/CN4 y SMN. Este protocolo añade un novedoso sistema de cultivo CN3/CN4 in vitro a los protocolos existentes y proporciona simultáneamente un cultivo SMN puro para la comparación de especies y edades. Los análisis centrados en las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras son factibles en este sistema de cultivo. Este protocolo permitirá investigar los mecanismos que definen el desarrollo de neuronas motoras, la vulnerabilidad selectiva y las enfermedades.
Introduction
El cultivo de las neuronas motoras primarias es una poderosa herramienta que permite el estudio del desarrollo neuronal, función, y la susceptibilidad a los estresores exógenos. Los cultivos de neuronas motoras son particularmente útiles para el estudio de enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)1,2, cuyos mecanismos de enfermedad se entienden incompletamente. Curiosamente, a pesar de la muerte celular significativa de las neuronas motoras espinales (SMN) tanto en pacientes con ELA como en ratones modelo DE ELA, la muerte celular en neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas trocleares (CN4s) son relativamente escasas1,3,4,5,6,7,8,9. Por lo tanto, los análisis comparativos de cultivos puros de CN3s/CN4s y SMN podrían proporcionar pistas importantes sobre los mecanismos subyacentes a la vulnerabilidad relativa. Desafortunadamente, una barrera importante a tales análisis ha sido la incapacidad para cultivar cultivos purificados de estas neuronas motoras.
Se han descrito muchos protocolos para la purificación de las SMN a partir de modelos animales. La mayoría de estos protocolos utilizan centrifugación de gradiente de densidad10,11,12 y/o p75NTR-técnicas de panoramización de clasificación celular basadas en anticuerpos13,14,15,16. La centrifugación de gradiente de densidad explota el mayor tamaño de las SMN en relación con otras células espinales, mientras que p75NTR es una proteína extracelular expresada exclusivamente por las SMN en la médula espinal. Casi 100% cultivos SMN puros han sido generados por uno o ambos de estos protocolos11,12,14. Sin embargo, estos protocolos no han tenido éxito en generar las culturas CN3/CN4 porque los CN3s/CN4 no expresan elNTRp75, y otros marcadores específicos CN3/CN4 no han sido identificados. También son más pequeños que los SMN y, por lo tanto, son más difíciles de aislar en función del tamaño. En cambio, los estudios in vitro de CN3s o CN4 se han basado endesvincular17,18,19,20,21, explantar17,22,23,24,25,26, y la rebanada27,28 cultivos, que se componen de tipos de células heterogéneas, y no han existido protocolos para el aislamiento y cultura de los CN3 primarios o CN4.
Aquí, se describe un protocolo para la visualización, aislamiento, purificación y cultivo de CN3, CN4 y SMN del mismo día embrionario 11.5 (E11.5) IslMN:GFP ratones transgénicos29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP etiqueta específicamente las neuronas motoras con un GFP farnesylated que se localiza en la membrana celular. Este protocolo permite la comparación de múltiples tipos de neuronas motoras con el fin de dilucidar los mecanismos patológicos en la enfermedad de las neuronas motoras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Históricamente, los estudios in vitro de neuronas motoras CN3 y/o CN4 han recurrido a cultivos heterogéneos como disociados17,18,19,20,21, explantar17,22,23,24,25,26</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, EE. UU.) la instrucción en técnicas de disección SMN; el Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, el Immunology Division Flow Cytometry Facility of Harvard Medical School, The Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women’s Hospital Flow Cytometry Core, y Boston Children’s Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neuron; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, miembros adicionales del laboratorio engle y miembros del consorcio Project ALS para asistencia técnica y discusión reflexiva. Este estudio fue apoyado por el Proyecto ELA. Además, R.F. fue financiado por la Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad y NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748; J.J. contó con el apoyo del programa de capacitación NIH/NEI en las Bases Moleculares de Enfermedades Oculares (5T32EY007145-16) a través del Instituto de Investigación Ocular schepens y el Programa de Capacitación en Neurología del Desarrollo (5T32NS007473-19) a través del Hospital Infantil de Boston; M.C.W contó con el apoyo de NEI (5K08EY027850) y Children’s Hospital Ofthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); y E.C.E. es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | – | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | – | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7ml Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | – | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | – | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
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