زيادة متانة مزارع الخلايا العصبية المنفصلة باستخدام مصفوفة المرجان النشطة بيولوجيا
Summary
تعد زراعة خلايا الحصين المنفصلة أداة تجريبية محورية في علم الأعصاب. يتم تعزيز بقاء الخلايا العصبية ووظيفتها في الثقافة عند استخدام الهياكل العظمية المرجانية كمصفوفات ، بسبب أدوارها العصبية والعصبية. وبالتالي ، فإن الخلايا العصبية التي تزرع على مصفوفة المرجان تظهر متانة أعلى ، وبالتالي فهي أكثر ملاءمة للزراعة.
Abstract
تعد مزارع الخلايا العصبية والدبقية المنفصلة في الحصين نموذجا تجريبيا قيما لدراسة النمو العصبي ووظيفته من خلال توفير عزل عالي للخلايا وبيئة خاضعة للرقابة. ومع ذلك ، فإن بقاء خلايا الحصين في المختبر معرض للخطر: تموت معظم الخلايا خلال الأسبوع الأول من الثقافة. لذلك من الأهمية بمكان تحديد طرق لزيادة متانة الخلايا العصبية في الثقافة.
يمكن استخدام كربونات الكالسيوم في شكل أراغونيت بلوري مشتق من الهيكل العظمي للشعاب المرجانية كمصفوفة متفوقة ونشطة للثقافات العصبية. من خلال رعاية الخلايا الدبقية وحمايتها وتنشيطها ، يعزز الهيكل العظمي المرجاني بقاء ونمو هذه الخلايا في المختبر بشكل أفضل من المصفوفات الأخرى.
يصف هذا البروتوكول طريقة لزراعة خلايا الحصين على مصفوفة مرجانية. يتم إنشاء هذه المصفوفة عن طريق ربط حبيبات الهياكل العظمية المرجانية بأطباق الاستزراع والقوارير وأغطية الزجاج. تساعد الحبوب في تحسين بيئة الخلايا من خلال إدخالها إلى بيئة ثلاثية الأبعاد (3D) لتنمو وتشكل هياكل تشبه الأنسجة. يمكن تحسين بيئة 3D التي أدخلها الهيكل العظمي المرجاني للخلايا عن طريق الطحن ، مما يتيح التحكم في حجم وكثافة الحبوب (أي خشونة المصفوفة) ، وهي خاصية وجد أنها تؤثر على نشاط الخلايا الدبقية. علاوة على ذلك ، فإن استخدام الحبوب يجعل مراقبة وتحليل الثقافات أسهل ، خاصة عند استخدام المجهر الضوئي. ومن ثم ، يتضمن البروتوكول إجراءات لتوليد وتحسين مصفوفة الشعاب المرجانية كأداة لتحسين صيانة ووظائف الخلايا العصبية في المختبر.
Introduction
تعد مزارع الخلايا العصبية المنفصلة ، في هذه الحالة خلايا الحصين ، نموذجا تجريبيا قيما لدراسة النمو العصبي ووظيفته من خلال توفير عزل عالي للخلايا وإمكانية الوصولإليها 1،2،3. كثيرا ما يستخدم هذا النوع من الثقافة في علم الأعصاب ، وتطوير الأدوية ، وهندسة الأنسجة بسبب الكم الكبير من المعلومات التي يمكن جمعها ، مثل معدلات النمو والجدوى ، والسمية العصبية ، ونمو الخلايا العصبية والشبكات ، والاتصال المشبكي واللدونة ، والتعديلات المورفولوجية ، وتنظيم الخلايا العصبية والأسلاك ، إلخ.1،4،5،6،7.
على الرغم من أهمية الثقافات ، عادة ما تضطر الخلايا المزروعة إلى النمو على أغطية زجاجية في طبقة أحادية ثنائية الأبعاد. تقلل هذه التعديلات البيئية الصارمة بشكل كبير من قدرة الخلايا العصبية على البقاء على قيد الحياة بمرور الوقت ، لأن أغطية الزجاج هي ركائز غير مغذية ذات قوة التصاق منخفضة ، وتظهر قدرة أقل على دعم نمو الخلايا8،9،10،11.
نظرا لأن الخلايا العصبية المزروعة تضطر إلى النمو في ظروف صعبة ، فإن النهج الأساسي لتعزيز بقائها هو تقليد بيئتها الطبيعية قدر الإمكان12,13. يمكن تحقيق ذلك باستخدام المواد الحيوية التي ستعمل كمصفوفات وتحاكي المصفوفة خارج الخلية للخلايا ، مما يمكنها من تكوين بنية تشبه الأنسجة والمساعدة في تغذيتها14.
يعد استخدام المواد الحيوية نهجا واعدا في تحسين مزارع الخلايا ، لأنها تعمل كسقالات متوافقة حيويا ، وتوفر الاستقرار الميكانيكي وتعزز مجموعة متنوعة من خصائص الخلايا ، بما في ذلك الالتصاق والبقاء والانتشار والهجرة والتشكل والتمايز15،16،17. تستخدم عدة أنواع من المواد الحيوية لتحسين ظروف الخلايا في المختبر. من بينها البوليمرات الحيوية ، أو المكونات البيولوجية التي عادة ما تكون جزءا من المصفوفة خارج الخلية للخلايا. تستخدم هذه المواد الحيوية في الغالب كشكل من أشكال عوامل الطلاء المبلمرة أو الهلاميات المائية18،19،20. من ناحية ، تمنح المصفوفات المذكورة أعلاه الخلايا بيئة 3D مألوفة للنمو فيها ، وتشجع التصاقها بالطبق ، وتمنحها الدعم الميكانيكي21,22. من ناحية أخرى ، فإن شكلها المبلمر وحصر الخلايا داخل الهلاميات المائية يزعج وصول الخلايا إلى مكونات التغذية الموجودة في وسائط النمو ويجعل متابعة الخلايا بالطرق المجهرية أكثر صعوبة23.
الهياكل الخارجية المرجانية هي مصفوفات بيولوجية بحرية المنشأ. إنها مصنوعة من كربونات الكالسيوم ، ولها استقرار ميكانيكي ، وقابلة للتحلل. أظهرت الدراسات السابقة التي تستخدم الهيكل العظمي المرجاني كمصفوفة للخلايا العصبية المتنامية في الثقافة التصاق أكبر بكثير ، مقارنة بأغطية الزجاج24,25. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الخلايا العصبية المزروعة على الهيكل العظمي المرجاني قدرتها على تناول الكالسيوم الذي يتكون منه الهيكل العظمي ، والذي يحمي الخلايا العصبية في ظروف الحرمان من المغذيات26. علاوة على ذلك ، فإن الهيكل العظمي المرجاني عبارة عن مصفوفة داعمة ورعاية تزيد من بقاء الخلايا العصبية ، وتشجع على تكوين الشبكات العصبية ، وترفع معدل الاتصال المشبكي ، وتمكن من تكوين هياكل تشبه الأنسجة27,28. أظهرت الدراسات الحديثة أيضا أن التضاريس السطحية لمصفوفة الهيكل العظمي المرجاني تلعب دورا حاسما في توزيع وتنشيط الخلايا الدبقية 8,29. أيضا ، الهيكل العظمي المرجاني فعال كمصفوفة لزراعة أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا العظمية30،31 ، وخلايا الكبد ، وخلايا عضلة القلب في الثقافة (بيانات غير منشورة).
وبالتالي ، فإن الهيكل العظمي المرجاني هو مصفوفة واعدة لزراعة الخلايا في المختبر. وبالتالي ، يصف البروتوكول المفصل أدناه تقنية زراعة الخلايا العصبية على الهيكل العظمي المرجاني لإنتاج ثقافات عصبية أكثر استقرارا وازدهارا من تلك التي تحققها الطرق الحالية. قد يكون هذا البروتوكول مفيدا أيضا لزراعة الخلايا العضلية القلبية وخلايا الكبد وأنواع الخلايا الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف التقنية المعروضة هنا طريقة لتحسين صيانة الخلايا العصبية ووظائفها في الثقافة. يتم تحقيق ذلك من خلال لصق الخلايا بمصفوفة مصنوعة من حبيبات الهيكل العظمي المرجاني التي تغذي الخلايا وتعزز نموها ونشاطها. استخدام هذه التقنية يزيد من قدرة نموذج الثقافة العصبية على تقليد بيئة الخلايا في الدم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج KAMIN التابع لوزارة التجارة والعمل الإسرائيلية ومن قبل شركة Qrons Inc. ، 777 Brickell Avenue Miami ، FL 33131 ، الولايات المتحدة.
Materials
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L – glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
References
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
- Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
- Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
- Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
- Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
- Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O’Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
- Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
- Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
- Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
- Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
- Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
- Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
- Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
- Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
- Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005 (2019).
- Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
- Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
- Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- . Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019)
- Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
- Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
- Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
- Morad, T. . CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , (2019).
- Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).
