Summary

Real-time bioluminescentie beeldvorming van Inkeping signalering dynamiek tijdens Murine neurogenese

Published: December 12, 2019
doi:

Summary

Neurale stam/voorlopercellen vertonen verschillende expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten die leiden tot verschillende uitkomsten van cellulaire gebeurtenissen. Een dergelijke dynamische uitdrukking kan worden onthuld door real-time monitoring, niet door statische analyse, met behulp van een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem dat visualisatie van snelle veranderingen in genexpressies mogelijk maakt.

Abstract

Inkeping signalering regelt het onderhoud van neurale stam/progenitorcellen door celcelinteracties. De componenten van Inkeping signalering vertonen dynamische expressie. Inkeping signalering Effector Hes1 en de inkeping ligand Delta-like1 (dll1-) worden uitgedrukt in een oscillerende manier in neurale stam/voorlopercellen. Omdat de periode van de oscillerende expressie van deze genen zeer kort is (2 uur), is het moeilijk om hun cyclische expressie te monitoren. Om zulke snelle veranderingen in de genexpressie of eiwit dynamiek te onderzoeken, zijn snelle respons verslaggevers vereist. Vanwege de snelle rijpings kinetiek en hoge gevoeligheid is de Bioluminescentie reporter plaats geschikt om snelle genexpressie veranderingen in levende cellen te monitoren. We gebruikten een gedestabiliseerde plaats reporter voor het bewaken van de organisator activiteit en een plaats-gesmolten reporter voor visualisatie van eiwit dynamica bij een enkele celresolutie. Deze bioluminescentie verslaggevers vertonen een snelle omzet en genereren zeer zwakke signalen; Daarom hebben we een zeer gevoelig bioluminescentie beeldvormings systeem ontwikkeld om dergelijke zwakke signalen te detecteren. Deze methoden stellen ons in staat om verschillende genexpressie dynamiek in levende cellen en weefsels te monitoren, wat belangrijke informatie is om de werkelijke cellulaire toestanden te helpen begrijpen.

Introduction

Het zoogdier brein bestaat uit een groot aantal verschillende soorten neuronen en gliacellen. Alle cellen worden gegenereerd uit neurale stam/voorlopercellen (npc’s), die eerst prolifereren om hun getallen uit te breiden, dan beginnen te differentiëren in neuronen, en ten slotte geven aanleiding tot gliacellen1,2,3,4,5. Zodra cellen zijn gedifferentieerd in neuronen, ze kunnen niet vermenigvuldigen of hun aantallen te verhogen, en daarom, het onderhoud van Npc’s tot latere stadia is belangrijk. Notch signalering via celcelinteracties speelt een belangrijke rol bij het handhaven van npc’s6,7. Notch liganden interactie met het membraan eiwit, Inkeping, op het oppervlak van de naburige cellen en activeert de inkeping eiwit. Na activering komt proteolyse van Inkeping eiwit voor, waardoor het intracellulaire domein van Inkeping (NiCd) van het celmembraan in de Nucleus8,9,10wordt vrijgegeven. In de Nucleus bindt NICD aan de organisator regio’s van Hes1 en Hes5 (Hes1/5) en activeert de expressie van deze genen. Hes1/5 Druk op de uitdrukking van de proneural genen Ascl1 en Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Omdat proneural genen neuronale differentiatie induceren, spelen Hes1/5 essentiële rollen bij het onderhouden van npc’s. Bovendien, als proneural genen de uitdrukking van de inkeping ligand Delta-like1 (Dll1-) kunnen activeren, Hes1/5 ook onderdrukken de uitdrukking van dll1-. Daarom, de uitdrukking van Dll1-leidt tot de naburige cellen negatief voor Dll1-via inkeping signalering. Op deze manier, cellen remmen aangrenzende cellen van het volgen van hun zelfde lot, een fenomeen bekend als de laterale remming8. In de ontwikkelende hersenen speelt laterale remming een rol bij het genereren van verschillende celtypen.

Real-time beeldvorming op het niveau van één cel onthult dynamische expressies van de componenten van Inkeping signalering in npc’s15,16,17. Notch signalering activeert de uitdrukking van Hes1, maar Hes1 eiwit bindt aan zijn eigen promotor en onderdrukt zijn eigen uitdrukking. Bovendien is Hes1 een extreem onstabiel eiwit, dat wordt aangetast door het ubiquitin-proteasome traject; Daarom is de onderdrukking van zijn eigen promotor slechts van korte duur en vervolgens begint de transcriptie opnieuw. Op deze manier, de uitdrukking van Hes1 schommelt op zowel de transcriptie en translationele niveaus in een 2 h cyclus18. De oscillerende uitdrukking van Hes1 induceert op zijn beurt de oscillerende expressie van de downstream-doel genen, zoals Ascl1, Neurog2 en dll1-, via periodieke repressie15,16,17,19. Terwijl proneural genen neuronale differentiatie kunnen induceren, is hun oscillerende expressie niet voldoende voor Neuronale Differentiatie; hun aanhoudende expressie is veeleer essentieel voor de neuronale differentiatie. De oscillerende expressie van proneural genen is belangrijk voor het onderhouden van npc’s in plaats van voor het induceren van neuronale differentiatie14,15,16. De uitdrukking van dll1- oscilleert op zowel de transcriptie-als translationele niveaus tijdens verschillende morfogenese, zoals neurogenese en somitogenese. De dynamische expressie van dll1- is belangrijk voor de normale morfogenese en gestage expressie van dll1-induceert defecten in neurogenese en somitogenese17. Deze bevindingen tonen de belangrijke functie die de dynamiek van genexpressie en eiwit kinetiek heeft op de regulering van verschillende ontwikkelings gebeurtenissen (d.w.z. dat verschillende expressie dynamiek verschillende outputs in cellulair gedrag oplevert).

Voor het analyseren van de dynamiek van Inkeping signalering, de statische analyse van weefsels en cellen zijn onvoldoende omdat ze voortdurend veranderen. Real-time beeldvorming van enkele cellen is een krachtig hulpmiddel om de dynamiek in genexpressie te onthullen. De dynamische uitdrukking van inkepingen signalering moleculen ondergaan snelle cyclische reacties in de periode van 2-3 h. Deze snelle periodieke uitdrukking presenteert twee moeilijke problemen voor de real-time monitoring: (1) de uitdrukking van de moleculen wordt onderdrukt tot lage niveaus, en (2) snelle omzet vereist snelle respons Reporters. Om deze problemen te overwinnen, ontwikkelden we eerder een bioluminescentie real-time beeldvormings methode20. Omdat de Bioluminescentie reporter een hogere gevoeligheid en kortere rijpingstijd heeft dan fluorescerende reporters, stelt deze strategie ons in staat om de snelle dynamiek in levende cellen te monitoren. Met behulp van real-time visualisatie ontdekten we dat meer genen dynamische expressie vertoonden dan we eerder dachten. Daarnaast is het aantal rapporten met uitdrukking en eiwit dynamiek in levende cellen en de betekenis van deze dynamiek in verschillende biologische gebeurtenissen toegenomen, wat een fundamentele rol van de dynamiek in genexpressies21,22suggereert.

In dit rapport beschrijven we een manier om de uitdrukking van de inkeping ligand dll1-in npc’s in zowel gezien culturen als in corticale segment culturen te visualiseren. Om de dynamiek van dll1- transcriptie op één celniveau te monitoren, genereerden we gezien culturen van npc’s afgeleid van de embryonale telencephalon van transgene muizen met pDll1-UB-Fluc Reporter, een dll1-Promoter-gedreven gedestabiliseerde plaats Reporter. Om Dll1-proteïne dynamica in vivo te monitoren, introduceerden we de Dll1–Fluc Fusion reporter in Npc’s in de cortex en visualiseerde de uitdrukking van de reporter in Npc’s in corticale segment culturen. Real-time Imaging stelde ons in staat om de verschillende kenmerken van genexpressie en eiwit dynamiek in levende cellen te vangen met een hoge temporele resolutie.

Protocol

Alle procedures, waaronder dierproef personen, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van het Instituut voor grens leven en medische wetenschappen, de Universiteit van Kyoto. 1. bioluminescentie verslaggevers Opmerking: de plaats reporter is geschikt voor het meten van de snelle dynamiek van de organisator activiteit door het degradatie signaal te fusing. Bovendien maakt de plaats Fusion reporter het mogelijk om de eiwit dynamiek in de…

Representative Results

Uitdrukkingen van de genen Hes1/7 vertonen 2 uur oscillatie cyclus in verschillende cellijnen en tijdens de somitogenese. Bovendien is de periode van oscillatie zeer kort en zowel hun Mrna’s en eiwitten zijn zeer onstabiel met de halfwaardetijd van rond 20 min. Als we een trage reactie reporter gebruiken, kunnen we dergelijke snelle dynamiek niet traceren en als we een stabiele reporter gebruiken, accuiteert deze geleidelijk, terwijl de genexpressie oscilleert. Zo moet de melder snel worden afgebroken om de snel…

Discussion

De componenten van Inkeping signalering tonen oscillerende uitdrukkingen in Synchrony tijdens somitogenese maar uit Synchrony tijdens neurogenese, wat leidt tot de moeilijkheden bij het vastleggen van de expressie dynamiek door statische analyse in het laatste geval. Real-time monitoring is dus vereist om de expressie dynamiek van Inkeping signalering componenten, zoals Hes1 en dll1-te onthullen. Omdat de perioden van de expressies van Hes1 en dll1- oscillaties extreem kort zijn, zijn …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Yumiko Iwamoto voor de ondersteuning van de productie van de video. We zijn ook Akihiro Isomura dankbaar voor de bespreking en ondersteuning van beeldanalyse, Hitoshi Miyachi voor technische ondersteuning voor het genereren van transgene dieren, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) en OUIN Kunitaki (Andor Japan) voor de technische ondersteuning en discussies van het bioluminescentie beeldvormings systeem. Dit werk werd gesteund door kernonderzoek voor Evolutionele wetenschap en technologie (JPMJCR12W2) (R.K.), subsidie-in-steun voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden (MEXT 24116705 voor H.S. en MEXT 16H06480 voor R.K.), subsidie-in-steun voor wetenschappelijk onderzoek (C) (JSPS 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. en H.S.), en platform voor dynamische benaderingen van het woon systeem van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie, Japan.

Materials

Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller) Julabo Model: F12-ED
Cooled CCD camera Andor Technology Model: iKon-M 934
Incubator system TOKAI HIT Model: INU-ONICS
Inverted microscope Olympus Model: IX81
Inverted microscope Olympus Model: IX83
LED illumination device CoolLED Model: pE1
MetaMorph MOLECULAR DEVICES Model: 40000
Mix gas controller Tokken Model: TK-MIGM OLO2
Objective lens Olympus Model: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscope Nikon Model: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscope Leica Model: MZ16FA
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
PBS Nacalai Tesque 14249-24
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplement invitrogen 12587-010
bFGF invitrogen 13256-029 Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferin Nacalai Tesque 01493-85 Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNase Worthington Biochemical Corporation LK003172 Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSS Worthington Biochemical Corporation LK003188
Glass bottom dish IWAKI 3910-035
N2 supplement (100x) invitrogen 17502-048
N-acetyl-cystein Sigma A-9165-25G
Papain Worthington Biochemical Corporation LK003178 Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/Streptmycine Nacalai Tesque 09367-34
Poly-L-lysine Sigma P-6281 40 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringe TERUMO 181228T
Electrode Neppagene 7-mm
Electroporator Neppagene CUY21 EDIT
Forceps
Gauzes Kawamoto co. 7161
Micro capillary Made in-house
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Pentbarbital Kyoritsuseiyaku Somnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needle Akiyama MEDICAL MFG. CO F17-40B2
Xylazine Bayer Seractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
Culture insert Millipore PICM01250
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Fetal Bovine Serum Sigma 172012-500ML
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Forceps
Horse Serum Gibco 16050-122
Micro surgical knife Alcon 19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubator Panasonic MCO-5MUV-PJ
N2/B27 media Made in-house ref. NPC dissociatioin culture
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting board Made in-house

References

  1. Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
  2. Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
  5. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  6. Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
  7. Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
  8. Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  9. Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
  10. Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
  11. Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
  12. Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
  13. Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
  14. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
  15. Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
  16. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
  17. Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
  18. Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
  19. Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
  20. Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
  21. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
  22. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
  23. Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
  24. Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  25. Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
  26. Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
  27. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
  28. Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
  29. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  30. Hansen, A. S., O’Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
  31. Hansen, A. S., O’Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
  32. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
  33. Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
  34. Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
  35. Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
  36. Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).

Play Video

Cite This Article
Shimojo, H., Kageyama, R. Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis. J. Vis. Exp. (154), e60455, doi:10.3791/60455 (2019).

View Video