Selv om afføringskultur for Campylobacter er upræcis, betragtes den stadig som guldstandarden for identifikation. Metoder til bestemmelse af detektionsgrænsen og overlevelse i transportmedier af C. jejuni i human afføring er beskrevet og sammenlignet med en ny immunassay med bedre nøjagtighed.
En kultur fra menneskelig afføring til diagnosticering af Campylobacter-baseredetarmsygdom tager flere dage, en ventetid, der skatter styrke af lægen og patienten. En kultur er også tilbøjelig til falske negative resultater fra tilfældigt tab af levedygtighed under prøvehåndtering, overvækst af andre fækale flora, og dårlig vækst af flere patogene Campylobacter arter på traditionelle medier. Disse problemer kan forvirre kliniske beslutninger om patientbehandling og har begrænset området fra at besvare grundlæggende spørgsmål om Campylobacter vækst og infektioner. Vi beskriver en procedure, der anslår den nedre grænse for bakterietal, der kan påvises ved en kultur, og en metode til kvantificering af C. jejunis overlevelse i medier, der anvendes til transport af denne skrøbelige organisme. Kendskab til disse oplysninger, bliver det muligt at fastsætte klinisk relevante detektiontærskler for diagnostiske tests og løse uundersøgte spørgsmål om, hvorvidt ikke-symptomatisk kolonisering er udbredt, hvis co-infektion med andre enteriske patogener er fælles, eller hvis bakteriel belastning korrelerer med symptomer eller alvorlige sequelae. Undersøgelsen omfattede også test af 1.552 prospektivt indsamlet patient diarré fækal prøver, der oprindeligt blev klassificeret af konventionel kultur og yderligere testet af et nyt enzym immunoassay. Positive og discrepant prøver blev derefter screenet af fire molekylære metoder til at tildele sand-positiv eller sand-negativ status. De fem ikke-kulturmetoder viste fuldstændig enighed om alle 48 positive og ufortensprøver, mens de ikke-kultiverede 14 (28 %). De prøver, der fejlagtigt blev identificeret ved dyrkning, omfattede 13 falske negative og 1 falsk positiv prøve. Denne grundlæggende protokol kan bruges med flere Campylobacter spp. og vil gøre det muligt antallet af Campylobacter bakterier, der producerer symptomer på gastroenteritis hos mennesker, der skal bestemmes, og for prævalens satser, der skal opdateres.
Usa Centers for Disease Control (CDC) offentliggjorde for nylig, at Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) overvågningsprogram rapporterede 9.723 tilfælde af laboratoriediagnosticerede Campylobacter infektioner i 20181. Dette repræsenterer en stigning på 12 % i Campylobacter-sagsrapporter i 2015−20171. På verdensplan, Campylobacter spp. er blandt de mest almindelige bakterielle tarminfektioner2. Ikke desto mindre er antallet af Campylobacter-baseredetarmsygdomme, der opstår hvert år, mistænkt for at være underrapporteret3. Denne undervurdering er forudsigelig, fordi de fleste patienter kan komme sig med kun moderat ubehag og ingen medicinsk behandling. Men for patienter med mere alvorlige symptomer, eller som har en højere risiko for alvorlig sygdom, og som derefter søger lægehjælp, afføring kultur er den mest almindelige metode til at vurdere, om Campylobacter er patogen, der forårsager deres nød4.
For Campylobacter spp., afføring kultur er særligt generende. De mest almindelige patogene organismer, C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis, og C. lari, er mikroaerofile5. Det betyder, at bakterierne vil dø tilfældigt, ukendte satser, når de udsættes for luft. Tiden mellem prøveindsamling og kulturopsætning bliver således en ukontrolleret variabel i evnen til at detektere levedygtig campylobacter spp. af kultur.
For direkte kultur af fækale prøver, den langsomme vækst i Campylobacter er også et problem. Campylobacter kolonier er meget små, selv efter 48 h inkubation og kan nemt dækkes af konkurrerende organismer i fækal matrix. Plader, der indeholder antibiotika, som de fleste stammer af C. jejuni og C. coli er resistente er meget udbredt, som antibiotika hæmmer væksten af mange (men ikke alle) konkurrerende fækale bakterier, så bedre visualisering af Campylobacter kolonier 6. Men andre Campylobacter arter som C. lari og C. upsaliensis er følsomme over for nogle af disse antibiotika, og enten vokse dårligt eller slet ikke. Dette bidrager til underrapportering af Campylobacter infektioner fra disse antibiotika-følsomme arter7.
Der er en tredje grund til, at en kultur for Campylobacter kan være unøjagtig. Bakterierne, når de er stressede, kan forblive levedygtige, men kan blive “ikke-skyldmes”8. Dette betyder pr. definition, at kulturen ikke registrerer de bakterier, der findes i prøven. Hvor ofte dette sker, er ikke kendt8.
I betragtning af disse potentielle problemer med kultur, vi brugte flere sammenligning referencemetoder, således at defekte kultur resultater ikke gøre en enkelt komparator assay synes unøjagtige9. De anvendte dyrkningsmetoder (f.eks.
De kulturprotokoller, der er beskrevet her, blev udviklet, fordi det laveste antal Campylobacter jejuni, der kunne påvises af kultur i menneskelig afføring, ikke var kendt. Selv om der er offentliggjort skøn for antallet af kolonidannende enheder (CFU) til stede i fjerkræ afføring11, disse resultater kan ikke sidestilles med menneskelig afføring, som Campylobacter spp. er commensals i kyllinger, og ikke forårsager diarré. Denne grundlæggende information er nødvendig for at fastslå antallet af Campylobacter bakterier, der vil producere symptomer på gastroenteritis hos mennesker og til at sammenligne virulens mellem stammer eller arter.
De kulturmetoder, der er beskrevet her, er bygget på enkle, udbredte teknikker og materialer, der findes i de fleste laboratorier10. Det er kombinationen af analytiske og konstruerede prøver, der giver nye oplysninger om en klinisk relevant detektionstærskel for fækale kulturer. Derudover styrker afgørelsen af kulturresultater med 5 separate analyser konklusionerne om, at Campylobacter fækal kultur fejlidentificerer en betydelig del af patientprøver. VI og molekylære analyser er nyttige som kontroller, fordi de hver især er baseret på et andet princip (antigeninteraktion med antistof vs. DNA-forstærkning) og, hvad der er vigtigt, ikke er afhængige af bakteriers levedygtighed. Bemærk, at Den EIA-analyse, der anvendes til disse undersøgelser, er godt valideret og har vist sig at være helt enig i 4 molekylære test12.
Kultur Campylobacter spp. er særligt generende, med følsomhed rapporteret til at variere fra 60-76%19,20, og som det fremgår af sin ~ 30% sats for manglende påvisning af sande-positive prøver her. Personalet kan forvente, at kontrol VV og molekylære tests ofte vil give positive resultater, når kulturdata er negative.
Det mest kritiske skridt i protokollen er identifikationen af pin-point kolonier blandt konkurrerende fækal flora. Det er ikke usædvanligt, da fortyndinger i nærheden af detektionstærsklen, at have skøn over antal kolonier, der veksler mellem nul og ikke nul (f.eks. 2, 0, 1, 0, 0). Det er vigtigt at erkende, at kulturtærskler vil være en række koncentrationer, ikke en specifik CFU/ml. Ikke desto mindre, skønpå ~ 1 x 106 CFU / ml afføring som en nedre grænse for dyrkning afsløring sammenligner godt med rapporter om, at smittede mennesker kaste 106 til 109Campylobacter per gram afføring21. Ændringer i antibiotika eller agar plader og variationer uundgåelige i de enkelte fækale prøver vil uden tvivl ændre tærskelværdier. Denne protokol skulle muliggøre forbedringer i vækstmediet.
Disse første oplysninger om en grænse for dyrkningsdetektion gør det muligt at fastsætte klinisk relevante tærskler for diagnostiske test og lægger det mikrobiologiske fundament, der er nødvendigt for at løse uundersøgte spørgsmål om ikke-symptomatisk transport22,23 af Campylobacter, eller hvis bakteriel belastning korrelerer med symptomer eller alvorlige sequelae.
The authors have nothing to disclose.
Disse undersøgelser blev finansieret af TECHLAB, Inc.
Anaerobic 3.5L Jar | Thermo Fisher | HP0031A | |
AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar | Hardy Diagnostics | AG701 | |
Bacto Brain Heart Infusion | BD Biosciences | 237500 | |
Bacto Protease Peptone | Life Technologies Corp | 211684 | |
Basic Fuchsin | Fisher Scientific | B12544 | |
BBL Trypticase Peptone | Life Technologies Corp | 211921 | |
C. coli Type strain | ATCC | 33559 | |
C. jejuni Type strain | ATCC | 33560 | |
CampyGen gas generating system sachet | Thermo Fisher | CN0025A | |
Campylobacter QUIK CHEK | TechLab, Inc. | T5047 / T31025 | |
Cary-Blair transport medium | Fisher Scientific | 23-005-47 | |
Coli Roller Sterile plating beads | Millipore Sigma | 71013 | |
Dilution Buffer | Anaerobe Systems | AS-908 | |
Fetal bovine serum | Equitech-Bio, Inc | SFBM30 | |
Sodium bisulfite | Sigma-Aldrich | 243973 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
Spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 |