Erhöhte Spinalflüssigkeitsproteinspiegel können entweder das Ergebnis der Diffusion von Plasmaprotein über eine veränderte Blut-Hirn-Schranke oder intrathekale Synthese sein. In diesem Artikel wird ein optimiertes Testprotokoll vorgestellt, das hilft, beide Fälle zu unterscheiden und quantitative Messungen von intrathekalen synthetisierten Proteinen liefert.
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Methodenartikel
Quantitative Messung von intrathecally Synthetisierten Proteinen bei Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Cerebrospinalfluid (CSF), eine Flüssigkeit im Gehirn und im Rückenmark gefunden, ist von großer Bedeutung für die grundlegende und klinische Wissenschaft. Die Analyse der CSF-Proteinzusammensetzung liefert wichtige Informationen in der grundlagenspezifischen neurowissenschaftlichen Forschung sowie neurologischen Erkrankungen. Eine Einschränkung besteht darin, dass Proteine, die in CSF gemessen werden, sowohl aus der intrathekalen Synthese als auch aus der Transudation aus Serum stammen können, und die Proteinanalyse von CSF kann nur die Summe dieser beiden Komponenten bestimmen. Um zwischen Proteintransudation aus dem Blut und intrathekal produzierten Proteinen in Tiermodellen sowie beim Menschen zu unterscheiden, müssen CSF-Proteinprofilierungsmessungen mit herkömmlichen Proteinanalysewerkzeugen die Berechnung des Albumin-CSF/Serumquotienten(Q-Albumin), eines Markers für die Integrität der Blut-Hirn-Schnittstelle (BBI) und des Proteinindex (Q-Protein/Q-Albumin ), eine Schätzung der intrathekalen Proteinsynthese umfassen. Dieses Protokoll veranschaulicht das gesamte Verfahren, von der CSF- und Blutentnahme bis hin zu Quotienten und Indexberechnungen, zur quantitativen Messung der intrathekalen Proteinsynthese und BBI-Beeinträchtigung in Mausmodellen neurologischer Störungen.
Einleitung
Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), eine klare und farblose Flüssigkeit, die das Gehirn und das Rückenmark umgibt, hat eine große klinische und grundlegende wissenschaftliche Bedeutung. Das CSF bewahrt die elektrolytische Umgebung des Zentralnervensystems (ZNS), gleicht den systemischen Säure-Basenstatus aus, versorgt neuronale und gliale Zellen mit Nährstoffen, fungiert als Lymphsystem für das ZNS und transportiert Hormone, Neurotransmitter, Zytokine und andere Neuropeptide durch das ZNS1. Da die CSF-Zusammensetzung die Aktivität des ZNS widerspiegelt, bietet diese Flüssigkeit einen wertvollen, wenn auch indirekten Zugang, um den physiologischen u....
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Protokoll
Alle Tierarbeiten verwenden Protokolle, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Geisel School of Medicine in Dartmouth überprüft und genehmigt wurden.
1. Sammlung von Flüssigkeiten
HINWEIS: Sowohl Serum als auch CSF sind erforderlich. Für das Überleben und die Nekropsie werden zwei Protokolle für jede Flüssigkeitssammlung benötigt.
- Serum- und CSF-Sammlung unter Verwendung von Überlebensverfahren
HINWEIS: Für die Survival-Flüssigkeitssammlung sollte die Serumsammlung der CSF-Sammlung vorausgehen, da es sich um ein weniger invasives Verfahren handelt. CSF muss innerhalb einer....
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Ergebnisse
Dieses repräsentative Experiment zielte darauf ab, die intrathekale Synthese von IgG in zwei klinisch relevanten Nagetiermodellen der Multiplen Sklerose (MS) zu vergleichen: die PLP139-151-induzierte schubförmige experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis (R-EAE) und die chronisch progressive, Theiler-Murinen-Enzephalomyelitis-Virus-induzierte Demyelinating-Krankheit (TMEV-IDD). R-EAE ist ein nützliches Modell zum Verständnis schubförmiger MS, während das TMEV-IDD-Modell chronisch progressive MS
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Diskussion
Quantitative Methoden zur Bewertung erhöhter CSF-Proteinkonzentrationen sind nützliche Werkzeuge zur Charakterisierung des physiologischen und pathologischen Zustands des ZNS. Über die zuverlässige Quantifizierung des CSF-Proteinspiegels hinaus erfordert der Nachweis von CSF-Proteinen jedoch eine Expression von Ergebnissen, die zwischen blut- und zNS-abgeleiteten Fraktionen im CSF unterscheiden. Bislang erlauben die häufig verwendeten Proteinquantifizierungstests jedoch keine Diskriminierung zwischen den beiden Proteinko.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren danken den Mitarbeitern des Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) in Dartmouth für ihre fachkundige Betreuung der Mäuse, die für diese Studien verwendet werden. Der Bornsteiner Forschungsfonds finanzierte diese Forschung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 mL Insulinspritze | BD | 329650 | |
| 1 mL Spritze | BD | 329622 | |
| 25 Gauge Nadel | BD | 305122 | |
| 3 mL Spritze | BD | 309582 | |
| 30 Gauge Insulin Nadel | BD | 305106 | |
| Saugeinlagen | Jede passende Marke | ||
| Acepromazin | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilierter Nachweis Antikörper | Jede geeignete Quelle | Der Antikörper muss gegen die Spezies gerichtet sein das Protein von Interesse. | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphinhydrochlorid | PAR Pharmazeutisch | NDC 42023-179-05 | |
| Kapillarröhrchen | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm Borosilikatglas 10 cm; über Bunsen gezogen, um den ID zu verkleinern. |
| Zentrifugenröhrchen, 0,2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Zentrifugenröhrchen, 0,5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Zentrifugenröhrchen, 1,5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidindiacetat | Nolvasan | E004272 | |
| Einwegpipettenspitzen | Jede passende Marke | ||
| Ohrstangen | KOPF Instruments | 1921 oder 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Gefrierschrank | VWR | VWR32086A | |
| Gaze | Medline | NON25212 | |
| Heizkissen | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heizstufen mit automatischer Abschaltung, Blaugrün, 12 Zoll x 24 Zoll | |
| Induktionskammer | VETEQUIP | ||
| Isofluran | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamin (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Mikrosphären (Antikörper-gekoppelt) | BioRad | Antikörper-gekoppelte magnetische Kügelchen | |
| Mikroplattenschüttler | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt - 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Maus Immunglobulin Isotypisierung Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Kommerzielles Kit für die Quantifizierung eines Panels von Immunglobulin-Isotypen und -Unterklassen in Mausflüssigkeiten durch Luminex. |
| Maus-Albumin-Capture-ELISA-Kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Kommerzielles Kit für die Quantifizierung von Albumin in Mausflüssigkeiten durch ELISA. |
| Mehrkanalpipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Unsterile Tupfer | MediChoice | WOD1002 | müssen für die Sterilität autoklaviert werden |
| Sauerstoff | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippetten | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS Naht mit Einwegnadel, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipettierer | Eppendorf | Research Schläuche | |
| Kühlzentrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Skalpellfeder | EF7281 | ||
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standardproteine | Jede geeignete Quelle | Die beste Wahl für einen Referenzstandard ist eine gereinigte, bekannte Konzentration des interessierenden Proteins. | |
| Stereotaktisches Instrument | KOPF Instruments | Modell 900LS | Standard Zubehör |
| Steril 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile Kochsalzlösung | Baxter | 0338-0048-02 | 0,9 % Natriumchlorid Spülung USP |
| Chirurgische Pinzette gebogen, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Chirurgische Schere | Fine Science Tools | 14094-11 | Edelstahl 25x |
| Verdampfer + Durchflussmesser | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warmhaltekissen | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Wasser-Ultraschallgerät | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazin | Patterson Vet Supply Inc |
Referenzen
- Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
