Cellule d'immunofluorescence utilisant IBA1 et TMEM119 pour la densité microgliale, la morphologie et l'analyse périphérique d'infiltration de cellules myéloïdes dans le cerveau de souris
Summary
Ce protocole décrit un workflow étape par étape pour la costaining immunofluorescente d’IBA1 et de TMEM119, en plus de l’analyse de la densité, de la distribution et de la morphologie microgliales, aussi bien que l’infiltration périphérique de cellules myéloïdes dans le tissu de cerveau de souris.
Abstract
Il s’agit d’un protocole pour la double visualisation des microglies et l’infiltration de macrophages dans le tissu cérébral de la souris. TMEM119 (qui étiquette les microglies de manière sélective), lorsqu’il est combiné avec IBA1 (qui fournit une visualisation exceptionnelle de leur morphologie), permet d’enquêter sur les changements dans la densité, la distribution et la morphologie. La quantification de ces paramètres est importante pour fournir des informations sur les rôles exercés par les microglies, les macrophages résidents du cerveau. Dans des conditions physiologiques normales, les microglies sont régulièrement distribuées en mosaïque et présentent un petit soma avec des processus ramifiés. Néanmoins, en réponse à des facteurs environnementaux (c.-à-d. traumatisme, infection, maladie ou blessure), la densité microgliale, la distribution et la morphologie sont modifiées de diverses manières, selon l’insulte. En outre, la méthode de double coloration décrite permet la visualisation des macrophages infiltrants dans le cerveau basé sur leur expression de IBA1 et sans colocalisation avec TMEM119. Cette approche permet ainsi la discrimination entre les microglies et les macrophages infiltrants, ce qui est nécessaire pour fournir des informations fonctionnelles sur leur implication distincte dans l’homéostasie du cerveau à travers divers contextes de la santé et la maladie. Ce protocole intègre les derniers résultats en neuroimmunologie qui se rapportent à l’identification des marqueurs sélectifs. Il sert également d’outil utile pour les neuroimmunologistes expérimentés et les chercheurs qui cherchent à intégrer la neuroimmunologie dans les projets.
Introduction
Qu’elle soit grave ou chronique, la neuroinflammation est fortement influencée par les microglies, les macrophages résidents du cerveau. La visualisation des microglies par immunostaining est précieuse pour l’étude de la neuroinflammation avec l’utilisation de la microscopie légère, une technique très accessible. Dans des conditions homéostatiques, les microglies sont généralement distribuées dans un modèle non superposé, ressemblant à une mosaïque. Ils présentent de petits somas qui prolongent les processus ramifiés1, qui parfois se contactentles uns lesautres 2 . Les processus ramifiés microglial s’enduisent dynamiquement sur le parenchyme cérébral, interagissant avec les neurones, les autres cellules gliales et les vaisseaux sanguins dans des conditions physiologiques normales3. Les microglies sont équipées d’un arsenal de récepteurs qui leur permettent d’effectuer des tâches immunologiques et de répondre aux changements dans le milieu cérébral, à la mort cellulaire ou aux lésions tissulaires. En outre, ils exercent des fonctions physiologiques clés, notamment dans la formation synaptique, l’entretien et l’élimination4,5.
Parmi les marqueurs disponibles utilisés pour étudier les microglies, la molécule ionisée d’adaptateur de liaison de calcium 1 (IBA1) est l’un des plus largement utilisés. IBA1 est une protéine de liaison de calcium qui fournit la visualisation exceptionnelle de la morphologie microgliale, y compris les processus distal fins, comme confirmé par la microscopie électronique6. Cet outil a joué un rôle déterminant dans la caractérisation de la transformation microgliale, anciennement appelée « activation », dans un vaste éventail de modèles de maladies animales7,8,9. En présence de neuroinflammation, la réponse microgliale comprend : la microgliose qui est définie comme une augmentation de la densité cellulaire, les changements de distribution qui se traduisent parfois par le regroupement, l’élargissement du corps cellulaire, ainsi que l’épaississement et raccourcissement des processus associés à des formes plus améboïdes10,11,12,13.
L’immunostaining est limité par la disponibilité d’anticorps dirigés contre des marqueurs spécifiques. Surtout, IBA1 est exprimé par des microglies mais aussi par des macrophages périphériques qui s’infiltrent dans le cerveau14. Tandis que l’observation des cellules IBA1-positives à l’intérieur du cerveau est devenue un marqueur des microglies dans ce domaine de recherche, l’infiltration périphérique de macrophage a été rapportée dans diverses conditions, même marginalement dans le cerveau sain15,16 ,17,18. Par conséquent, l’utilisation d’IBA1 seule ne permet pas la visualisation sélective des microglies. En outre, les macrophages adoptent des caractéristiques moléculaires et morphologiques des microglies résidentes une fois qu’ils ont infiltré le cerveau, empêchant ainsi la différenciation19. Cela représente un défi lors de l’étude de la fonction des microglies et de l’infiltration de macrophages.
Bien que les microglies et les macrophages périphériques aient des origines distinctes (p. ex., du sac de jaune embryonnaire et de la moelle osseuse, respectivement20,21), il y a un nombre croissant de résultats indiquant que les deux populations cellulaires exercent différents rôles dans le cerveau19. Il est donc crucial d’utiliser des méthodes qui font la distinction entre ces deux populations sans manipulations invasives (c.-à-d. chimères de moelle osseuse ou parabiose) qui peuvent moduler leur densité, leur distribution, leur morphologie et leur fonction. TMEM119 a émergé comme un marqueur microglies-spécifiques à travers la santé et les conditions de la maladie22. Lorsqu’il est combiné avec IBA1, ce marqueur devient utile pour différencier ces cellules de l’infiltration macrophages, qui sont TMEM119-négatif et IBA1-positif. Bien qu’il soit réglementé par le développement, TMEM119 est exprimé dès les jours postnatals 3 (P3) et 6 (P6), augmentant régulièrement jusqu’à atteindre les niveaux adultes entre P10 et P1422. IBA1 est exprimé dès le jour embryonnaire 10.5 (E10.5)23. Le protocole de double étiquetage proposé est donc utile pour étudier ces deux populations tout au long de la vie postnatale.
Ce protocole fournit une procédure d’immunostaining étape par étape qui permet la discrimination entre les microglies et les macrophages périphériques. Il explique également comment effectuer une analyse quantitative de la densité, de la distribution et de la morphologie des microglies, ainsi que l’analyse de l’infiltration périphérique de macrophage. Tandis que l’étude des microglies et des macrophages périphériques est utile en soi, ce protocole permet en outre la localisation des foyers neuroinflammatoires ; ainsi, il sert également de plate-forme pour identifier des régions spécifiques à étudier, avec l’utilisation de techniques complémentaires (encore plus longues et consommatrices de ressources).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole peut être divisé en deux parties critiques : la qualité de la coloration et l’analyse. Si la coloration n’est pas optimale, elle ne représentera pas adéquatement les cellules microgliales, affectant ainsi la densité, la distribution et les mesures de morphologie. En outre, la proportion de cellules myéloïdes périphériques d’infiltration peut être sous-estimée. Il s’agit d’une version optimisée du protocole de coloration, mais il existe plusieurs facteurs qui peuvent entraîner des images sous-op…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Nathalie Vernoux pour ses conseils et son aide dans les expériences. Nous tenons également à remercier les Drs Emmanuel Planel et Serge Rivest pour l’utilisation de leur fluorescence et de leurs microscopes confocals, respectivement. Ces travaux ont été financés en partie par des bourses du Conseil mexicain des sciences et de la technologie (CONACYT; à F.G.I),Fondation Famille-Choquette et Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; à K.P.), Du Fonds de Recherche du Québec – Santé (à M.B.), et L’Institut indo-canadien Shastri (à K.B.), ainsi qu’une subvention de découverte du Conseil canadien de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) à M.E.T. M.E.T. est titulaire d’une chaire de recherche du Canada (niveau II) sur la plasticité neuroimmune en santé et en thérapie.
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse | Invitrogen/Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit | Invitrogen/Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well multidish | Thermo Fisher | 930186 | |
| Bovine serum albumin | EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759-500G | |
| DAPI Nuceleic acid stain | Invitrogen/Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Gelatin from coldwater fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Microscope coverglass | Fisher Scientific | 1254418 | |
| Microslides positively charged | VWR | 48311-703 | |
| Monoclonal mouse Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4·H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306, SPM400 | |
| Na2HPO4 | BioShop Canada Inc. | SPD307, SPD600 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642500 | |
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 017-000-121 | |
| Normal goat serum (NGS) | Jackson ImmunoResearch laboratories Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| Rabbit monoclonal Anti-TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| Reciprocal Shaking bath model 25 | Precision Scientific | – | |
| Transfer pipette | |||
| Tris buffer hydrochloride | BioShop Canada Inc. | TRS002/TRS004 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML |
References
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