Détection des transcriptions de l'ARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de l'immunodéficience humaine
Summary
Les épingles à cheveux et les boucles d’ARN peuvent fonctionner comme amorces pour la transcription inverse (RT) en l’absence des amorces séquence-spécifiques, interférant avec l’étude des transcriptions antisense de chevauchement. Nous avons mis au point une technique capable d’identifier l’ARN spécifique aux brins, et nous l’avons utilisée pour étudier la protéine antisens HIV-1 ASP.
Abstract
Dans les rétrovirus, la transcription d’antisense a été décrite dans le type 1 de virus d’immunodéficience humaine (HIV-1) et le virus T-lymphotropic humain 1 (HTLV-1). Dans LE VIH-1, le gène ASP de protéine antisens est situé sur le brin négatif de l’env, dans le cadre de lecture -2, couvrant la jonction gp120/gp41. Dans le sens de l’orientation, la fin de 3′ du cadre de lecture ouverte ASP chevauche avec les régions hypervariables gp120 V4 et V5. L’étude de l’ARN ASP a été contrecarrée par un phénomène connu sous le nom de RT-auto-amorçage, par lequel les structures secondaires d’ARN ont la capacité de premier rinçage RT en l’absence de l’amorce spécifique, générant des cDNAs non spécifiques. L’utilisation combinée de la dénaturation à haut ARN avec des amorces inverses biotinylated dans la réaction de RT, avec la purification d’affinité de l’ADNc sur les perles magnétiques streptavidin-enduites, nous a permis d’amplifier sélectivement l’ARN d’ASP dans les cellules De T CD4MD dérivées des individus infectés par HIV-1. Notre méthode est relativement peu coûteuse, simple à exécuter, très fiable et facilement reproductible. À cet égard, il représente un outil puissant pour l’étude de la transcription antisens non seulement dans le VIH-1, mais aussi dans d’autres systèmes biologiques.
Introduction
Le gène de protéine antisens (ASP) est un cadre de lecture ouvert (ORF) situé sur le brin négatif du gène de l’enveloppe du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) (env), couvrant la jonction gp120/gp411. Au cours des 30 dernières années, plusieurs rapports ont montré que le gène DUVIH est en effet transcrit et traduit2,3,4,5,6,7,8,9. Bien que les transcriptions antisense d’ASP aient été entièrement caractérisées in vitro,jusqu’à récemment l’information au sujet de la production réelle de l’ARN d’ASP dans les patients était toujours manquante.
La séquence de l’ASP est inversée et complémentaire à env. Cela représente un obstacle majeur lorsque vous essayez de détecter les transcriptions pour ASP. Les méthodes standard de réaction en chaîne de transcription-polymérase inverse (RT-PCR) utilisent des amorces antisens spécifiques aux gènes pour synthétiser les ANN complémentaires (CDNA) de la polarité droite. Cette approche, cependant, ne permet pas de déterminer l’orientation (sens ou antisens) du modèle initial d’ARN, puisque les épingles à cheveux ou les boucles d’ARN peuvent primer RT dans les deux directions en l’absence des amorces10,un phénomène connu sous le nom d’auto-amorçage de RT. La plupart des chercheurs de l’ASP écartent le problème de l’auto-amorçage de RT à l’aide d’amorces étiquetées avec des séquences qui ne sont pas liées au VIH-111,12. Toutefois, cette stratégie n’élimine pas l’occurrence du phénomène et peut entraîner un report potentiel des ADCD non spécifiques dans le PCR11.
Nous avons récemment mis au point un nouvel essai RT-PCR spécifique au brin pour l’étude de l’ARN antisens et nous l’avons utilisé pour la détection de l’ARN ASP dans une cohorte de six patients infectés par le VIH, comme le montre le tableau 1. La procédure décrite ci-dessous a déjà été publiée par Antonio Mancarella et coll.13. Dans notre protocole, nous évitons la production de CDNA non spécifiques par une double approche. Tout d’abord, nous éliminons les structures secondaires de l’ARN en dénaturant l’ARN à haute température (94 oC), et deuxièmement, nous rincions l’ARN ASP à l’aide d’une amorce spécifique à l’ASP biotinylated et l’affinité purifie l’ADNc résultant. Par cette approche, nous sommes en mesure d’amplifier seulement notre cDNA cible, puisque d’autres produits NON spécifiques de RT sont empêchés d’être générés (dénaturation à haute température de l’ARN) ou éliminés avant PCR (purification d’affinité).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons un essai de RT spécifique au brin appliqué à la détection de l’ARN ASP dans les cellules T CD4MD isolées chez des personnes infectées par le VIH-1. L’occurrence de l’amorçage non spécifique pendant RT entrave la détection des transcriptions d’ARN avec la polarité droite, menant à l’interprétation erronée des résultats. Les groupes précédents ont développé plusieurs stratégies visant à empêcher la synthèse d’ADNc amorce-indépendante pendant la réaction de RT. Le mar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick et Matthieu Perreau d’être toujours disponibles pour discuter de notre travail et de toutes les personnes du Laboratoire d’immunopathogenèse du sida pour leur précieuse assistance technique. Nous tenons également à remercier John et Aaron Weddle de VSB Associated Inc. qui ont contribué avec d’excellentes œuvres d’art. Enfin, un grand merci à tous les patients, sans qui ce travail n’aurait pas été possible. Ces travaux n’ont reçu aucune subvention spécifique d’un organisme de financement.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
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