Påvisning af humant immundefekt virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA-transskriptioner hos patienter med streng specifik RT-PCR
Summary
RNA Hårnåle og sløjfer kan fungere som primere for reverse transkription (RT) i fravær af sekvens-specifikke primere, forstyrrer studiet af overlappende antisense udskrifter. Vi har udviklet en teknik, der kan identificere streng-specifik RNA, og vi har brugt det til at studere HIV-1 antisense protein ASP.
Abstract
I retrovira er antisense transkriptionen blevet beskrevet i både humant immundefektvirus type 1 (HIV-1) og humant T-lymfotropic virus 1 (HTLV-1). I HIV-1 er antisense protein ASP-genet placeret på den negative del af env, i læse ramme-2, der spænder overkrydset gp120/gp41. I Sense-retningen overlapper den 3 ‘ ende ASP-åbne læse ramme med gp120 hypervariable-områder v4 og v5. Studiet af ASP-RNA er blevet modstået af et fænomen kendt som RT-Self-Priming, hvorved RNA sekundære strukturer har evnen til at prime RT i fravær af den specifikke primer, genererer ikke-specifikke cDNAs. Den kombinerede anvendelse af høj RNA-denaturering med biotinylerede omvendte primere i RT-reaktionen sammen med affinitets rensning af cDNA på streptavidin-belagte magnetiske perler har gjort det muligt for os selektivt at forstærke ASP-RNA i CD4 + T-celler afledt af personer inficeret med HIV-1. Vores metode er relativt lave omkostninger, enkel at udføre, meget pålidelig og let reproducerbar. I denne henseende, det repræsenterer et effektivt redskab til undersøgelse af antisense transkriptionen ikke kun i HIV-1, men også i andre biologiske systemer.
Introduction
Antisense protein (ASP) genet er en åben læse ramme (ORF), der er placeret på den negative del af humant immundefektvirus type 1 (HIV-1)-genet (ENV), der spænder overkrydset gp120/gp411. I løbet af de sidste 30 år har flere rapporter vist, at hiv ASP-genet faktisk er transskriberet og oversat2,3,4,5,6,7,8,9. Selvom ASP antisense udskrifter er blevet fuldt karakteriseret in vitro, indtil for nylig oplysninger om den faktiske produktion af ASP RNA hos patienter stadig manglede.
Rækkefølgen af ASP er omvendt og komplementær til env. Dette udgør en stor forhindring, når du forsøger at registrere udskrifter for ASP. Standard reverse transkription-polymerase kædereaktion (RT-PCR) metoder bruger gen-specifikke antisense primere til at syntetisere komplementære DNAs (cDNAs) af den rigtige polaritet. Denne tilgang tillader dog ikke at bestemme retningen (Sense eller antisense) af den oprindelige RNA-skabelon, da RNA-Hårnåle eller sløjfer kan Prime rt i begge retninger i fravær af primere10, et fænomen kendt som rt Self-Priming. De fleste ASP-efterforskere undgik problemet med RT-selv priming ved hjælp af primere Tagged med sekvenser, der ikke er relateret til HIV-111,12. Denne strategi eliminerer imidlertid ikke forekomsten af fænomenet og kan føre til potentiel fremførsel af ikke-specifikke Cdna’er i PCR11.
Vi har for nylig udviklet en ny streng specifik RT-PCR-analyse til studiet af antisense RNA, og vi har brugt det til påvisning af ASP-RNA i en kohorte af seks HIV-inficerede patienter, som vist i tabel 1. Den nedenfor beskrevne fremgangsmåde er tidligere blevet offentliggjort af Antonio Mancarella et al.13. I vores protokol undgår vi produktion af ikke-specifikke cDNAs ved en dobbelt tilgang. For det første fjerner vi RNA-sekundære strukturer ved at denaturere RNA ved høj temperatur (94 °C), og for det andet omskriver vi ASP-RNA ved hjælp af en biotinyleret ASP-specifik primer og affinitet-renser det resulterende cDNA. Ved denne fremgangsmåde er vi i stand til kun at forstærke vores mål-cDNA, da andre ikke-specifikke RT-produkter enten forhindres i at blive genereret (høj temperatur denaturering af RNA) eller elimineres før PCR (affinitets rensning).
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne rapport beskriver vi en streng specifik RT-analyse, der anvendes til påvisning af ASP-RNA i CD4 + T-celler isoleret fra personer, der er inficeret med HIV-1. Forekomsten af ikke-specifik priming under RT hæmmer påvisning af RNA-udskrifter med den rigtige polaritet, hvilket fører til fejlfortolkning af resultaterne. Tidligere grupper har udviklet flere strategier, der har til formål at forhindre primer-uafhængig cDNA-syntese under RT-reaktionen. Tagging af den omvendte primer ved 3 ‘ ende med sekvenser, der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick og Matthieu Perreau for altid at være til rådighed for at diskutere vores arbejde og alle de mennesker i laboratoriet af AIDS immunopathogenesis for deres dyrebare tekniske bistand. Vi vil også gerne takke John og Aaron Weddle fra VSB Associated Inc., der bidrog med fremragende kunst. Endelig mange særlig tak til alle de patienter, uden hvem dette arbejde ikke ville have været muligt. Dette arbejde modtog ikke noget specifikt tilskud fra et finansierings agentur.
Materials
| BD LSR II | Becton Dickinson | ||
| BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4337450 | |
| dNTP Set (100 mM) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 10297018 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19052 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1010-500 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | Becton Dickinson | 554714 | |
| HIV Gag p24 flow cytometry antibody – Kc57-FITC | Beckman Coulter | 6604665 | |
| Human IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-743 | |
| Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA) | Sigma-Aldrich | 61764-1MG | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | L34967 | |
| Mouse Anti-Human CD28 | Becton Dickinson | 55725 | |
| Mouse Anti-Human CD3 | Becton Dickinson | 55329 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00-H | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11304011 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 18080044 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4369016 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | K450001 | |
| TURBO DNase (2 U/µL) | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific | 4375786 |
References
- Miller, R. H. Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand. Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).
- Vanheebrossollet, C., et al. A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals. Virology. 206 (1), 196-202 (1995).
- Briquet, S., Vaquero, C. Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles. Virology. 292 (2), 177-184 (2002).
- Clerc, I., et al. Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells. Retrovirology. 8, 74 (2011).
- Landry, S., et al. Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1. Retrovirology. 4, 71 (2007).
- Kobayashi-Ishihara, M., et al. HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period. Retrovirology. 9, 38 (2012).
- Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region. DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).
- Laverdure, S., et al. HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells. Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).
- Zapata, J. C., et al. The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly. Virology. 506, 34-44 (2017).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).
- Lerat, H., et al. Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells. The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).
- Tuiskunen, A., et al. Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA. J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).
- Mancarella, A., et al. Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Journal of General Virology. , (2019).
- Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR. J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).
- Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera. Virol J. 6, 221 (2009).
- Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs. J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).
- Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA. J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).
- Barbeau, B., Mesnard, J. M. Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs). Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).
