Gravação eletrofisiológica sem fio dos neurônios por tetrodes móveis em peixes livremente da natação

Summary

Uma nova técnica sem fio para a gravação de sinais neurais extracelulares do cérebro de peixinho dourado livremente natação é apresentado. O dispositivo de gravação é composto por dois tetródos, um microdrive, um registrador de dados neurais e uma caixa impermeável. Todas as peças são feitas medida, exceto para o registrador de dados e seu conector.

Abstract

Os mecanismos neurais que regem o comportamento dos peixes permanecem em sua maioria desconhecidos, embora os peixes constituam a maioria de todos os vertebrados. A capacidade de registrar a atividade cerebral de peixes em movimento livre avançaria a pesquisa com base neural do comportamento dos peixes consideravelmente. Além disso, o controle preciso do local de gravação no cérebro é fundamental para estudar a atividade neural coordenada em todas as regiões do cérebro de peixes. Aqui, apresentamos uma técnica que grava sem fio do cérebro de peixes nadando livremente enquanto controlamos a profundidade do local de gravação. O sistema é baseado em um madeireiro neural associado a um novo implante compatível com água que pode ajustar o local de gravação por tetés controlados por microdrive. As capacidades do sistema são ilustradas através de gravações do telencefalon de peixinho dourado.

Introduction

Os peixes são o maior e mais diversificado grupo de vertebrados, e como outros vertebrados eles exibem habilidades cognitivas complexas, como navegar, socializar, dormir, caçar, etc. No entanto, os mecanismos neurais que regem o comportamento dos peixes permanecem em sua maior parte desconhecidos.

Nas últimas décadas, gravações extracelulares de peixes imobilizados foram implementadas principalmente para investigar diferentes aspectos da base neural do comportamento^1,2. Embora esta técnica seja apropriada para alguns sistemas sensoriais, a investigação de todo o espectro da base neural de comportamento é difícil, se não impossível, em animais imobilizados. Os primeiros avanços envolveram a gravação das células Mauthner de peixes de natação amarrados^3,4. No entanto, as células Mauthner são desproporcionalmente grandes e as amplitudes potenciais de ação registradas, que podem ir tão alto quanto alguns mV, facilitam a gravação. Mais tarde, Canfield et al. descreveu uma prova de conceito ao usar um animal amarrado para gravar a partir do telencefalon de^{peixes 5}. Outra técnica recente para o registro da atividade neural a partir de peixes é a imagem de cálcio (ver comentários de Orger e de Polavieja⁶, e Vanwalleghem et al.⁷). Esta técnica foi desenvolvida para uso com larvas de zebrafish porque a pele e o crânio são transparentes durante o estágio larval. No entanto, esta técnica não pode ser usada para estudar comportamentos complexos em estágios posteriores de desenvolvimento.

Aqui, apresentamos uma nova técnica para a gravação da atividade neural extracelular dos cérebros dos peixes nadadores livremente. Esta é uma versão modificada do protocolo descrito em Vinepinsky et al.⁸. A principal inovação é a adição de um microdrive que possibilita controlar a posição dos eletrodos após a cirurgia. A técnica é projetada para a gravação do telencephalon do goldfish usando um jogo dos tetrodes que são conectados a um registrador neural dos dados através de uma microdrive. Toda a configuração é sem fio e ancorada no crânio do peixe. O peso específico do sistema é igualado ao peso específico da água, adicionando um pequeno flutuador que permite que os peixes nadem livremente.

A técnica é baseada no uso de um registrador de dados neural que amplifica, digitaliza e armazena o sinal em um dispositivo de memória a bordo. O sistema de telemetria madeireiro é usado para iniciar e parar as gravações, e para sincronização com a câmera de vídeo. Neste protocolo, um madeireiro neural de 16 canais é usado, embutido em uma caixa impermeável junto com o microdrive.

A montagem de microdrive é fabricada a partir de dois componentes principais: o microdrive em si e a carcaça de microdrive (Figura 1A,B). A habitação contém o microdrive e os tetrodes, e também atua como a âncora entre o crânio ea caixa madeireiro (Figura 1C). A caixa de registrador de PVC é fabricada usando um processo de máquina e é selada usando um Anel O(Figura 1E-G, veja também figura suplementar 1, Figura Suplementar 2e Figura Suplementar 3 para um diagrama tridimensional [3D]). Em uma extremidade, um pedaço de espuma de poliestireno é anexado à caixa de cabeçudo para compensar o peso do implante e fornecer o peixe com um implante neutro em flutuabilidade. A construção do microdrive descrito no protocolo segue o procedimento apresentado por Vandecasteele et al.⁹ com uma modificação para anexar o microdrive à habitação (Figura 1A). Todos os passos principais são apresentados.

O procedimento descrito no protocolo para preparar o crânio de peixe é semelhante ao apresentado em Vinepinsky et al.⁸ e é descrito brevemente no protocolo. Um dia após a cirurgia, os peixes são normalmente totalmente recuperados dos efeitos da anestesia e estão prontos para os experimentos comportamentais. Observe que a localização do téts pode ser ajustada girando o parafuso de microdrive. O parafuso tem um espaçamento de 300 μm por rotação completa e um avanço de 75 μm é recomendado até que a localização do cérebro alvo seja atingida. Um atlas cerebral apropriado deve ser consultado para atingir a região específica do cérebro de interesse. É aconselhável testar a impedância do elétrodo cada vez que os peixes são anestesiados para a bateria ou a recolocação do cartão de memória.

Protocol

Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser aprovados pelos comitês de ética locais sobre bem-estar animal (por exemplo, IACUC). 1. Construção da habitação Microdrive Para construir a habitação, corte uma placa de bronze de 1 mm de largura em uma placa de 19 mm x 29 mm x 1 mm usando uma serra. Corte duas fendas de 5,5 mm em cada um dos lados longos perpendiculares à borda, de modo que cada fenda é de 6,5 mm de distância dos lados estreitos (Figura 2</…

Representative Results

Durante uma sessão de gravação, o peixinho dourado nadou livremente em um tanque de água quadrada, enquanto a atividade neural em sua telencefalon foi gravada. O objetivo desses experimentos era estudar como a atividade neural das células individuais determina o comportamento do peixe. Para isso, a atividade de cravagem precisava ser identificada nos dados registrados. A atividade cerebral, ao ser registrada, foi digitalizada em 31.250 Hz e alta passagem filtrada a 300 Hz pelo regist…

Discussion

Este protocolo detalha as etapas envolvidas na implantação de uma matriz de tetróda na telencefalon de peixinho dourado livremente natação. Esta técnica implementa um madeireiro neural que amplifica e registra os sinais adquiridos de até 16 canais, juntamente com um microdrive que pode ajustar a posição tetróna no cérebro. O microdrive torna possível ajustar a posição no cérebro para otimizar a gravação.

Este protocolo pode ser facilmente modificado para gravação de outras r…

Materials

0.7 mm round drill bits			Compatible with the drill.
15-blade Scalpel	Sigma-Aldrich
16 channel PCB board	Neurlynx	EIB-16
1X3M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
1X3M phillips round head screws			Stainless steel. Any type.
27 cm X 19 cm X 1 mm brass plate			See Figure 2
2X6M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
3140 RTV coating	Dow Crowning	2767996
75 µm Silver wire	A-M Systems
Brass machine screws #00-90		947-1006
Brass plates 7.5mm X 2.5mm X 0.6mm			A 3D drawing is provided. See supplementary 1
Coated Tungsten wire 25µm	California Fine Wire Company	5000160	Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000)
Coated Tungsten wire 50µm	A-M Systems	795500	Can be replaced with any other wire with low impedance
Cyanoacrilic glue
Dental Burnisher	ComDent UK		Any small sterille stainless-still tool will do.
Dental cement – GCFujiPLUS	GC	431011	Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other.
Dental drill or nail polish drill			Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement.
Drill bit #65		947-65
Fast curing epoxy			Any 5 minutes curing epoxy can be used here.
Logger box with O-ring sealing			A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger.
Motorized turning device			Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means.
Mouselog-16 Neural logger	Deuteron Technologies Ltd		There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98%
Nano-Z plating	White Matter LLC		The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics.
PCB pins	Neurlynx	Neuralynx EIB Pins
Polymide tubing 250µm	A-M Systems	822000
Rechargable battery			3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time.
Silicone tubing 0.64 mm	A-M Systems	806100
Stainless steel 1.5 mm	A-M Systems	846000
Sudium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S9625
Tap #00-90		947-1301
Vaseline			Any type of soft petroleum skin protectant can be used here.