Trådløs elektrofysiologisk innspilling av neurons av Movable Tetrodes i fritt svømming Fish

Summary

En roman trådløs teknikk for innspilling ekstracellulære nevrale signaler fra hjernen av fritt svømming gullfisk presenteres. Innspillingen enheten består av to tetrodes, en Microdrive, en nevrale data logger, og en vanntett sak. Alle deler er skreddersydd med unntak av data logger og dens kontakt.

Abstract

De nevrale mekanismene som regulerer fiske atferden forblir for det meste ukjent, selv om fisken utgjør flertallet av Alle virveldyr. Evnen å fortegnelse hjerne aktivitet fra fritt flytter fisken ville fremskritt forskning på neural basis av fisken opptreden atskillig. Videre er presis kontroll av innspillingen plassering i hjernen avgjørende for å studere koordinert nevrale aktivitet på tvers av regioner i fisk hjernen. Her presenterer vi en teknikk som registrerer trådløst fra hjernen av fritt svømming fisk mens du kontrollerer dybden på innspillingen plassering. Systemet er basert på en neural logger assosiert med en roman vann-kompatible implantat som kan justere innspillingen plasseringen av Microdrive-kontrollerte tetrodes. Evnene av systemet er belyst igjennom registreringene fra Telencephalon av goldfish.

Introduction

Fisken er det størst og høyst Miscellaneous gruppe av virveldyr, og like annet virveldyr de forevise innviklet Cognitive evnene som navigering, sosialt samvær, sovende, jakten, etc. Likevel er det nevrale mekanismer som regulerer fiske atferden fortsatt for det meste ukjent.

I de siste ti årene har ekstracellulære innspillinger fra immobilisert fisk primært blitt iverksatt for å undersøke ulike aspekter av det nevrale grunnlaget for atferden^1,2. Selv om denne teknikken er hensiktsmessig for noen sensoriske systemer, etterforskning av hele spekteret av nevrale grunnlag av atferd er vanskelig om ikke umulig i immobilisert dyr. Den første fremskritt involvert innspillingen fra Mauthner celler av bundet svømming fisk^3,4. Men Mauthner celler er uforholdsmessig store og den registrerte handlingen potensielle amplituder, som kan gå så høyt som noen mV, lette innspillingen. Senere, Canfield et al. beskrevet et bevis på konseptet når du bruker et bundet dyr til posten fra Telencephalon av fisk⁵. En annen nyere teknikk for opptak neural aktivitet fra fisk er kalsium Imaging (se anmeldelser av Orger og de Polavieja⁶, og Vanwalleghem et al.⁷). Denne teknikken ble utviklet for bruk med sebrafisk larver fordi huden og skallen er gjennomsiktige under larvestadiet scenen. Imidlertid kan denne teknikken ikke brukes til å studere komplekse atferd i senere stadier av utviklingen.

Her presenterer vi en ny teknikk for innspilling ekstracellulære nevrale aktivitet fra hjernen av fritt svømming fisk. Dette er en modifisert versjon av protokollen som er beskrevet i Vinepinsky et al.⁸. Den viktigste innovasjonen er tilsetning av en Microdrive som gjør det mulig å kontrollere posisjonen til elektrodene etter operasjonen. Teknikken er beregnet på innspillingen fra Telencephalon av goldfish benytter en sette av tetrodes det er koplet å en nevrale data ført inn i loggbok via en Microdrive. Hele oppsettet er trådløst og forankret til fiske skallen. Den spesifikke vekten av systemet er equalized til vann-spesifikk vekt ved å legge en liten dupp som gjør at fisken å svømme fritt.

Teknikken er basert på bruk av en nevrale data logger som forsterker, digitaliserer, og lagrer signalet i en onboard minneenhet. Den logger telemetri systemet brukes til å starte og stoppe opptakene, og for synkronisering med videokameraet. I denne protokollen, en 16-kanals neural logger brukes, innebygd i en vanntett boks sammen med Microdrive.

Den Microdrive forsamlingen er fabrikkert fra to hovedkomponenter: selve Microdrive og Microdrive huset (figur 1A, B). Huset holder Microdrive og tetrodes, og fungerer også som ankeret mellom skallen og logger boksen (figur 1C). PVC-logger boksen er fabrikkert ved hjelp av en maskin prosess og er forseglet ved hjelp av en O-ring (figur 1E-G, se også supplerende figur 1, supplerende figur 2, og supplerende figur 3 for et tredimensjonalt [3D]-diagram). I den ene enden, er et stykke av polystyren skum festet til logger boksen for å kompensere for vekten av implantatet og gi fisken med en oppdrift-nøytralt implantat. Konstruksjonen av Microdrive som er beskrevet i protokollen følger prosedyren presentert av Vandecasteele et al.⁹ med en modifikasjon for å feste Microdrive til huset (figur 1a). Alle de viktigste trinnene er presentert.

Prosedyren er beskrevet i protokollen for å forberede fisken skallen ligner den som presenteres i Vinepinsky et al.⁸ og er beskrevet kort i protokollen. En dag etter operasjonen, er fisken normalt helt utvinnes fra virkningene av anestesi og er klar for atferds eksperimenter. Legg merke til at sperrende plassering kan justeres ved å dreie på Microdrive skruen. Skruen har en avstand på 300 μm per full rotasjon og en avansement på 75 μm anbefales til målet hjernen plasseringen er nådd. En hensiktsmessig hjernen Atlas bør konsulteres for å målrette den spesifikke hjernen regionen av interesse. Det er tilrådelig å teste elektroden impedans hver gang fisken er anesthetized for batteri eller minnekort erstatning.

Protocol

Alle kirurgiske prosedyrer må godkjennes av lokale etikk komiteer på dyrevelferd (f. eks, IACUC). 1. bygging av Microdrive Housing For å konstruere huset, kutt en 1 mm bred messingplate i en 19 mm x 29 mm x 1 mm plate ved hjelp av en SAG. Skjær to 5,5 mm åpninger på hver av de lange sidene vinkelrett på kanten, slik at hver spalte er 6,5 mm unna de smale sidene (figur 2A). Ved hjelp av tang, brett området mellom spalten…

Representative Results

Under en innspillingen samling det goldfish svømte fritt inne en kvadrat vanntank stund det neural aktivitet i sin Telencephalon var registrert. Målet med disse eksperimentene var å studere hvordan neural aktivitet av enkeltceller bestemmer fisken atferd. For å gjøre dette, skyter aktivitet som trengs for å bli identifisert i de registrerte data. Hjernen aktivitet, som samtidig er registrert, ble digitalisert på 31 250 Hz og High-pass filtrert på 300 Hz av data logger. Offline, et…

Discussion

Denne protokollen detaljene foranstaltningene involvert inne implanting en sperrende oppstille inn i Telencephalon av fritt svømmer goldfish. Denne teknikken implementerer en neural logger som forsterker og registrerer signalene ervervet fra opptil 16 kanaler sammen med en Microdrive som kan justere sperrende posisjon i hjernen. Microdrive gjør det mulig å justere posisjonen i hjernen for å optimalisere opptaket.

Denne protokollen kan enkelt endres for opptak fra andre hjerneregioner (se V…

Materials

0.7 mm round drill bits			Compatible with the drill.
15-blade Scalpel	Sigma-Aldrich
16 channel PCB board	Neurlynx	EIB-16
1X3M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
1X3M phillips round head screws			Stainless steel. Any type.
27 cm X 19 cm X 1 mm brass plate			See Figure 2
2X6M phillips flat head screws			Stainless steel. Any type.
3140 RTV coating	Dow Crowning	2767996
75 µm Silver wire	A-M Systems
Brass machine screws #00-90		947-1006
Brass plates 7.5mm X 2.5mm X 0.6mm			A 3D drawing is provided. See supplementary 1
Coated Tungsten wire 25µm	California Fine Wire Company	5000160	Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000)
Coated Tungsten wire 50µm	A-M Systems	795500	Can be replaced with any other wire with low impedance
Cyanoacrilic glue
Dental Burnisher	ComDent UK		Any small sterille stainless-still tool will do.
Dental cement – GCFujiPLUS	GC	431011	Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other.
Dental drill or nail polish drill			Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement.
Drill bit #65		947-65
Fast curing epoxy			Any 5 minutes curing epoxy can be used here.
Logger box with O-ring sealing			A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger.
Motorized turning device			Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means.
Mouselog-16 Neural logger	Deuteron Technologies Ltd		There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98%
Nano-Z plating	White Matter LLC		The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics.
PCB pins	Neurlynx	Neuralynx EIB Pins
Polymide tubing 250µm	A-M Systems	822000
Rechargable battery			3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time.
Silicone tubing 0.64 mm	A-M Systems	806100
Stainless steel 1.5 mm	A-M Systems	846000
Sudium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S9625
Tap #00-90		947-1301
Vaseline			Any type of soft petroleum skin protectant can be used here.