Summary
이 원고의 목표는 RING 형 E3 유비퀴틴 리가제의 포괄적 인 생화학 및 기능 적 연구에 대한 개요를 제시하는 것입니다. 상세한 프로토콜을 갖춘 이 다단계 파이프라인은 테스트된 단백질의 효소 활성을 검증하고 활성을 작동하도록 연결하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
단백질의 번역 후 변형으로 유비퀴틴화는 진핵 세포의 항상성에 중요한 규제 역할을합니다. 폴리유비퀴틴 사슬의 길이 및 토폴로지에 따라 표적 단백질에 76개의 아미노산 유비퀴틴 개질제의 공유 부착은 단백질 분해에서 변형된 단백질의 국소화 및/또는 활성에 이르는 다양한 결과를 초래할 수 있다. 세 가지 효소는 유비퀴틴 화 과정을 순차적으로 촉매: E1 유비퀴틴 활성화 효소, E2 유비퀴틴-컨쥬게이팅 효소, E3 유비퀴틴 리가제. E3 유비퀴틴 리가제는 기질 특이성을 결정하고, 따라서, 매우 흥미로운 연구 대상을 나타낸다. 여기에서 우리는 링형 E3 유비퀴틴 리가제의 효소 활성 및 기능 사이의 관계를 연구하는 포괄적인 접근법을 제시한다. 이 4단계 프로토콜은 보존된 RING 도메인을 표적으로 하는 부위 지향 돌연변이 발생을 통해 E3 리가제 결핍 돌연변이를 생성하는 방법을 1) 기술한다; 2-3) 시험관 내 및 질라에서 모두 유비퀴틴화 활성을 검사하는 방법; 4) 이러한 생화학 적 분석을 시험 된 단백질의 생물학적 유의에 연결하는 방법. E3 리가제 결핍 돌연변이체의 생성은 여전히 그것의 기질과 상호작용하지만 더 이상 분해를 위해 그것을 유비퀴틴화하지 않는 것은 생체 내에서 효소 기질 상호작용의 시험을 용이하게 한다. 더욱이, 보존된 RING 도메인에 있는 돌연변이는 RNA 간섭 접근에 대한 대안적인 접근으로 기능적인 녹아웃 연구 결과에서 이용될 수 있는 지배적인 음성 표현형을 수시로 부여합니다. 우리의 방법은 기생충을 승진시키기 위하여 식물 세포에 있는 호스트 유비퀴틴화 시스템을 납치하는 식물 기생 선충 이펙터 RHA1B의 생물학 역할을 조사하기 위하여 낙관되었습니다. 생체 내 발현 시스템의 약간의 변형으로, 이 프로토콜은 기원에 관계없이 임의의 RING 형 E3 리가제의 분석에 적용될 수 있다.
Introduction
E3 유비퀴틴 리가제의 대다수는링(Really Interesting New Gene)형 단백질에 속한다. 링 핑거 도메인은 원래 프리몬트 외. 도 1및 단백질-단백질 상호작용을 중재하는 도메인으로서 기능적으로기술된다. 정식 링 핑거는 다른 아미노산 잔기(X), C-X 2-C-X9-39-C-X1-3-3-H-X2-C-X-C-4-C-4-C-C-4-C-C-48에의해 특별히 이격된 8개의 보존된 Cys(C)와 그의 (H)의 합의 서열로 정의된 특별한 유형의 아연 조정 도메인입니다. 2개의 Zn2+ 이온은 C1/C2 및 C/H5/C6이온을 조정하는 독특한 "크로스 브레이스" 토폴로지와 코어 C 및 H 잔류물로 안정화되는 반면 C3/H4 및 C7/C8은 두 번째(그림1A)3,4를결합합니다. 제5 Zn2+조정 사이트에서 C 또는 H의 존재에 따라, 링 핑거 단백질의 두 개의 표준 하위 클래스가 정의되었다: C3HC4 및 C3H2C3 (RING-HC 및 RING-H2, 각각). E3 유비퀴틴 리가제의 RING 도메인은 E2 컨쥬게이팅 효소와 기질 사이의 상호작용을 중재하기 때문에, 이들 필수 C 및 H 잔기의 돌연변이는 리가제 활성을 방해하는 것으로 나타났다5. 링 E3 리가제의 5개의 덜 일반적인 하위 클래스(RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T 및 RING-G)가추가로설명되었습니다. 링형 E3 유비퀴틴 리가스는 간단하고 복잡한 E3 효소로 더 세분화될 수 있다. 간단한 단일 소유닛 링 E3 리가제는 기판 인식 사이트 및 E2-결합 RING 도메인을 모두 포함한다. 대조적으로, 멀티 서브유닛 링형 E3 컴플렉스는 E3 단지에 E2-유비퀴틴 중간체의 결합을 모집하는 기판 또는 중재자 중 하나이다. 자기 유비퀴틴화를 위한 1차 유비퀴틴 부착 부위역할을 하는 링 도메인 Lys sidue(들)는 또한 E3 리가제 활성에 대해 중요할 수 있다.
모든 링 함유 단백질이 E3 리가제로서 기능하는 것은 아닙니다. 따라서, RING 핑거 도메인의 생물정보학적 예측 및 E2 의존단백질 유비퀴틴화에 대한 용량은 생화학적으로 검증되고 시험된 단백질의 생물학적 역할에 연결되어야 한다. 여기서, 우리는 사이트 지시돌연변이 유발 접근법을 통해 시험관 내 및 질라에서 RING형 E3 유비퀴틴 리가제의 효소 활성을 검출하고 기능적으로 특성화하는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 파이프라인의 대표적인 결과는 링형 E3 리가제 RHA1B에 대해 도시된다. RHA1B는 식물 면역을 억제하고 식물 뿌리 세포의 형태를 조작하기 위해 식물 기생 낭종 선충 글로보데라 팔리다에 의해 생성 된 이펙터 단백질이다. 병원체/기생충 침입으로부터 자신을 보호하기 위해, 식물은 병원체 또는 기생충의 존재를 감지하는 뉴클레오티드 결합 도메인 및 류신이 풍부한 반복 (NB-LRR) 유형 면역 수용체를 진화시켰으며, 결과적으로 감염 부위에서 발생하는 신속하고 국소화된 세포 사멸의 한 형태인 과민반응(HR)을 개발하여 병원균의 식민지화를 체포한다. 이러한 면역 수용체 중 하나는 G. pallida (필드 인구 D383 및 D372)의 일부 분리에 저항을 부여하는 감자 Gpa2 단백질7.
제시된 프로토콜을 사용하여, RHA1B는 유비퀴틴화 및 분해를 위한 식물 Gpa2 면역 수용체를 표적으로 하여 E3 의존적 방식으로 식물 면역 신호를 방해한다는 것을 최근 발견되었다8.
Protocol
1. 사이트 지시 돌연변이 발생(그림 1)
- RING 도메인에서 보존된 Cys 및 그의 아미노산을식별(도 1A)및 돌연변이 부위의 양쪽에 15개의 염기 쌍에 의해 측면에 있는 관심의 치환 코던을 운반하는 설계 프라이머(도1B).
- 제조사의 프로토콜에 따라 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이 총 PCR 반응 량의 50 μL에서 Pfu를 함유하는 뮤타게닉 프라이머 및 고충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 관심 있는 유전자를 항구하는 플라스미드의 PCR 기반 증폭에 의한 원하는 돌연변이를 소개한다.
- 대장균-유래부모 메틸화 및 반메틸화 DNA를 PCR 반응(단계 1.2)에 직접 3 μL의 DpnI 제한 효소를 첨가하고 2시간 동안 37°C에서 배양하여 소화한다.
참고: 메틸화는 플라스미드에 첨가되어 박테리아로부터 분리되는 전사 후 단백질 변형이다. PCR 생성 플라스미드의 새로운 사본은 메틸화 부족, 따라서, 새로운 사본은 DpnI 처리 도중 손상되지 않을 것입니다. - 스핀 컬럼 기술을 기반으로 한 상용 DNA 추출 키트를 사용하여 돌연변이 플라스미드를 정화하고 50 μL의 물로 DNA를 용해시다.
- 제조자의 프로토콜에 따라 회수된 돌연변이 플라스미드 DNA의 0.5 μL로 DH5α 대장균을 화학적으로 유능한 세포로 변형시킨다. 간단히 말해서, 30 분 동안 얼음에 DNA를 가진 유능한 세포를 배양한 다음 42 °C에서 20 s를 열 충격하고 2 분 동안 얼음에 튜브를 다시 놓고 250 rpm에서 37 °C에서 37 °C에서 500 μL의 배양 세포를 인큐베이트 한 다음 선택적 파테에 퍼뜨습니다.
- 대장균에서분리된 DNA 플라스미드를 Sanger시퀀싱하여 원하는 돌연변이를 확인합니다.
2. 재조합 단백질 정제 및 시험관 내 유비퀴틴 화 분석
- pMAL-c2 벡터로 관심 있는 야생형 링 및 돌연변이 링 유전자를 복제한다(제조사의 프로토콜을 따르라; 표 3) 아밀로스 수지를 사용하여 한 단계 정제를 허용하는 MBP 에피토프 태그와 이러한 유전자를 융합합니다. 1.5단계에서 설명한 바와 같이 생성된 컨스트럭트를 대장균 BL21 균주에 도입한다.
- 대장균 균주 BL21을 37°C에서 50 mL LB 액상 배지에서 2-3시간 동안 2-3시간 동안 원하는 구체를 포위한 성장(OD600 의 0.4-0.6).
- IPTG를 0.1-1 mMM의 최종 농도에 첨가하여 MBP 태그가 달린 재조합 단백질의 발현을 유도하고 28°C에서 2-3시간 동안 대장균 배양을 배양한다. 배양 후 얼음에 배양을 놓습니다.
참고: 단백질이 분해되지 않도록 얼음에 2.4-2.13단계를 수행합니다. - 유도 효율을 확인하려면 유도 된 세포의 1.5 mL를 수집하십시오. 2 분 동안 13,000 x g에서 스핀, 상판을 제거하고 2x SDS-PAGE 로딩 버퍼 (24 mM Tris-HCl pH 6.8, 0.8 % SDS, 10 % (v / v) 글리세롤, 4 mM DTT, 0.04 % (v/ v) 브로페올의 20 μL에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.
- 샘플을 5분 동안 끓여서 10% SDS-PAGE 젤로 실행합니다. MBP 융합 단백질(관심 있는 단백질분자 + 42.5kDa MBP)의 축적을 시각적으로 평가하기 위해, 쿠마시 염색 완충제(50% 메탄올, 10% 아세트산, 0.1% 쿠마시 블루)로 교반하여 젤을 20분 동안 염색하고 밤새 탈수 탈수 완충제 (20 % 메탄올, 10 % 아세트산).
- 나머지 대장균 세포를 1,350 x g에서 원심분리하여 6분 동안 수확하고, 상복부를 폐기하고, 5 mL의 컬럼 버퍼(20 mM Tris HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 세균성 프로테아제 억제제)로 세포 펠릿을 다시 중단한다.
참고: 이것은 밤새 프로토콜을 중지하는 좋은 장소입니다. 냉동 된 세포는 -20 °C에서 최대 1 주까지 저장할 수 있습니다. - 얼음 물 욕조에 박테리아를 포함하는 튜브를 배치하고 10 초음파 주기를 적용하여 대장균 세포를 분해 : 10 의 초음파 처리 30 % 암페어 후 20 의 휴식.
- 13,000 x g에서 10 분 동안 4 °C에서 원심 분리기 샘플을 저장하고 상위 (원유 추출물)를 저장합니다.
- 15 mL 튜브에 아밀로스 수지 500 μL을 준비합니다. 10 mL의 차가운 컬럼 버퍼를 추가하고 1,800 x g,4 °C에서 원심분리를 5 분 동안 추가하여 수지를 세척하십시오. 이 2x를 수행합니다.
- 아밀로스 수지와 튜브에 5 mL의 원유 추출물을 넣고 4 °C에서 밤새 배양합니다.
- 4°C에서 1,800 x g에서 원심분리기를 5분 동안 폐기하고 상급체를 버린다.
- 수지 펠릿에 10 mL의 컬럼 버퍼를 넣고 20 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 4 °C에서 1,800 x g에서 원심분리기를 5 분 동안 반복합니다.
- 4°C에서 2시간 동안 샘플을 인큐베이팅하여 10 mM 말토오스를 함유하는 0.5 mL의 컬럼 버퍼로 융합 단백질을 용해시다. 4°C에서 1,800 x g에서 원심분리기를 5분 동안 및 용출된 단백질을 수집한다. 이 단계를 2x 반복합니다.
- 차가운 PBS에 대하여 단백질 분획의 1 mL를 투석. Aliquot 단백질을 일회용 튜브(10-20 μL)에 넣어 동결 해동을 방지하고 필요할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
- 브래드포드 분석9를 사용하여 단백질농도를 측정한다.
- E1 40 ng(예: AtUBA1), E2 100 ng(예: AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32), 10μL의 총 부피에서 시험관 내 유비퀴틴화 반응을 설정합니다. 및 2 μg FLAG-Ub (또는 HA-Ub) 유비퀴틴화 완충제 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2,30 mM 크레아틴 인산염, 50 μg/mL 크레아틴 인산동물). 혼합물을 30°C에서 2시간 동안 배양한다.
참고: 20x 유비퀴틴화 버퍼를 미리 만들고 1회 사용시 작은 알리쿼트에 -20°C에서 최대 6개월까지 보관하십시오. 크레아틴 포스포키나제는 버퍼가 반복적으로 해동되고 동결될 때 효소 활성을 쉽게 잃게 됩니다. - 30 μL 샘플을 5x SDS-PAGE 로딩 버퍼(60 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 25% 글리세롤, 10 mM DTT, 0.1% (w/v) 브로모페놀 블루)의 7.5 μL로 혼합하고 5분 동안 끓여서 반응을 종료합니다.
- 7.5 % SDS 폴리 아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)으로 단백질을 분리 한 다음 PDVF 멤브레인으로 옮기고 안티 플래그 (또는 ANTI-HA)를 사용하여 서양 블로팅에 의한 유비퀴틴을 감지합니다.
- PVDF 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색하여 테스트된 MBP-RING 형 단백질의 동일한 하중을 확인합니다.
3. 아그로박테리움 -니코티아나 벤타미아나 잎과 질라 유비퀴틴화 분석에서 중재된 일시성 단백질 발현
- 관심있는 에피토프 태그 유전자를 운반하는 적절한 아그로박테리움 tumefaciens 균주 (예를 들어, HA-RHA1B, HA-RHA1BC135S,HA-RHA1BK146R,HA-Ub) 및 빈 벡터는 적절한 선택 항생제를 포함하는 LB 배지에 대한 대조군으로서.
- 28°C에서 2일간 성장한 후, 단일 콜로니를 집어 들고 28°C/250 rpm에서 적절한 항생제로 LB 액상 배지에서 성장시키고 다른 24시간 동안 성장시.
- 농균 배양물의 100 μL을 적절한 항생제로 3 mL 신선한 LB로 옮기고, 후반 기하수성장 단계로 회전(250 rpm)으로 28°C에서 추가4-6시간 동안 배양을 배양한다.
- 농균 세포를 6분 동안 1,800 x g에서 스핀다운하고, 상복부를 버리고, 3 mL의 세척 버퍼로 세포를 다시 일시 중단합니다(50 mM MES pH 5.6, 28 mM 포도당, 2 mM NaH2PO4). 이 단계를 2x 반복합니다.
- 두 번째 세척 후, 유도 버퍼에서 세포를 재중단 (50 mM MES pH 5.6, 28 mM 포도당, 2mM NaH2PO4, 200 μM 아세토시링곤, 37 mM NH4Cl, 5 mM MgSO4.7H2O, 4 mM KCl, 18 μM FeSO4.7H2M 2M,2M2M2M2MM). 28 °C에서 추가 10-12 시간 동안 유도 버퍼로 세포를 배양합니다.
참고: 아세토시링존은 T-DNA 전달을 유도합니다. - 세포를 1,800 x g에서 6분 동안 원심분리하고, 상복부를 폐기하고, 2 mL의 침투 버퍼(10 mM MES pH 5.5, 200 μM 아세토시링곤)로 세포를 재중단한다.
참고 : 유도 버퍼로 배양 후 Agrobacteria 가 응집되면 응집 된 세포가 몇 분 동안 벤치에 두고 튜브의 바닥으로 가라 앉게하고 명확한 아그로 박테리움 현탁액을 3.6 단계로 진행하기 전에 새로운 튜브로 옮깁니다. - OD600 값을 사용하여 박테리아의 농도를 측정합니다(600 nm의 흡광도에서의 광학 밀도). OD600 값을 원하는 값으로 조정합니다.
참고: 일반적으로 0.2-0.4 사이의 OD600 값은 단일 농균 얼룩 발현에 가장 적합합니다. 다른 농균 균주의 조합이 적용되는 경우, 농업 균주의 총 OD600 값은 1을 초과하지 않아야합니다. - Agroinfiltrate 4 주 된 N. bethamiana 잎 부드럽게 바늘로 그들을 찌르고, 바늘 없이 주사기와 함께 Agrobacterium 손으로 주입. 마커 (일반적으로 직경 1-2cm)와 침투 잎 영역을 동그라미.
- 침투된 잎 조직을 36h 침투 후 수집한다. 액체 질소로 미세한 분말로 조직을 갈아.
- Resuspended tissue powder with 300 μL of protein extraction buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol, 1% polyvinylpolypyrrolidone, 1 mM PMSF, plant protease inhibitor cocktail) and centrifuge at 15,000 x g for 15 min at 4 °C.
- 상급체를 새 튜브로 옮김. 5x SDS-PAGE 로딩 버퍼를 최종 농도에 1x로 넣고 5분간 끓입니다.
- 10% SDS-PAGE 젤에 원유 단백질을 분리하고 PVDF 멤브레인으로 옮기고 항 HA로 프로브하여 질라 유비퀴틴화에서 검출합니다.
4. 질라의 효소 활동과 기능 사이의 연결고리 구축
참고: 예를 들어, RHA1B는 HR 세포 사멸을 억제하기 위해 내성 단백질 Gpa2의 분해를 촉진합니다. 이 단계에서는 RHA1B의 악성 활동이 E3 종속인지 확인하는 방법을 보여 주며 이 단계를 보여 주는 것입니다.
- 관심의 태그 유전자를 운반하는 줄무늬 적절한 아그로 박테리움 tumefaciens 균주 (이 예에서 HA-RHA1B, HA-RHA1BC135S,HA-RHA1BK146R,myc-Gpa2, RBP1) 및 대조군으로 빈 벡터. 단계를 따르십시오 3.1-3.8 Agrobacterium 준비 및 N. bethamiana 잎에 주입에 대 한.
- E3 의존성 기질 단백질 분해를 위해, 3.9-3.12 단계를 따르고 식물 세포에서 단백질 축적을 검출하기 위해 적절한 항체를 사용하여 서양 블로팅을 수행한다(예를 들어, 항-HA 및 항 MYC).
- E3 의존성 과민반응(HR)의 경우, 침입 후 2-4일 간 HR 세포 사멸 증상에 대해 아그로인으로침투된 잎을 모니터링한다.
Representative Results
본 섹션에서, 대표적인 결과는 PROSITE 예측 링-H2 형 도메인(132-176 아미노산)을 가지는 단일 소단위 E3 유비퀴틴 리가제 RHA1B의 검사에 사용되는 프로토콜에 대해 제공된다(132-176 아미노산)10. 도 1에도시된 바와 같이, E3 결핍 돌연변이 단백질을 얻기 위해서는, 링 도메인에서 8개의 보존된 Cs 또는 Hs 중 적어도 하나(도1A)는돌연변이가 될 필요가 있다(도1B). 따라서, 제1 단계로서, RHA1B, RHA1BC135S(링 도메인의 보존된C3에서 Ser에 의한 Cys의 치환) 및 RHA1BK146R(RHA1B에 존재하는 유일한 라이스에서 아르그에 의한 리스의 치환)의 2가지 돌연변이 버전이 생성되었다. 단일 소단위 E3 ligases는 유비퀴틴과 직접 상호 작용하는 것이 아니라 유비퀴틴을 품고 있는 유비퀴틴에서 기질로 유비퀴틴 전달을 중재하지만, Lys에서 E3의 자기 유비퀴틴화는 최대 효소 활성을 위해 필요할 수 있습니다.
도 2의서양 블로팅 결과는 시험된 단백질(예를 들어, MPB 융합 RHA1B~100 kDa)의 분자량에서 시작하여 상향 진행되는 다중 대역전 얼룩과 함께 전형적인 시험관 내 유비퀴틴 화 분석 결과를보여준다. 항HA 항체 인식 HA 태그 Ub는 상이한 길이의 폴리 유비퀴틴화 사슬에 통합되어, 이러한 전형적인 유비퀴틴 관련 사다리 유사 얼룩을 생성한다. 긍정적인 결과를 검증하기 위해 그림 2A는 개별 구성 요소(E1, E2, Ub 또는 MBP-RHA1B)가 없거나 MBP를 제어로 사용하고 얼룩진 유비퀴틴화 신호가 없는 모든 중요한 네거티브 컨트롤을 제공합니다. 더욱이, PVDF 멤브레인의 쿠마시 블루 염색은 모든 대조군에서 MBP-RHA1B 또는 MBP의 동등한 하중을 보였다.
도 2B는 특정 E2/E3 조합에 따라 시험관내 유비퀴틴화 결과가 어떻게 변화했는지를 나타낸다. 이 예제에서는 10개의 서로 다른 E2 패밀리를 나타내는 11개의 다른 E2를 테스트했습니다. 검출된 유비퀴틴화 활동은 신호 없음(얼룩 없음)에서 다른 분자량에서 시작되는 다중 대역 얼룩에 이르기까지 다양하며, 이는 다른 유비퀴틴화 패턴을 나타냅니다.
도 3은 시험된 단백질의 RING- 및 K 돌연변이버전에 대한 유비퀴틴화 분석 결과를 나타낸다. RHA1BC135S에 대한 효소 활성의 부족은 시험관 내에서 다중 대역 얼룩을 생성하거나질라에서다분화 신호를 촉진할 수 없음에 의해 지원된다(그림3B). 야생형 RHA1B의 효소 활성에 의해 부여된 강력한 유비퀴틴화 신호와는 대조적으로, 벡터 제어를 포함한 모든 시험된 샘플에서 자체적으로 질타에서 HA 태그가 붙은 Ub의 과발현이 기저 수준 유비퀴틴화를 주었다는 점은 주목할 만하다. 더욱이, RHA1BK146R 돌연변이체에 대한 분석은 K146 잔류물이 RHA1B의 E3 활성에도 필수적이라는 것을 시사한다. 시험관 내에서 한계 자가 유비퀴틴화 신호가검출되었지만(도 3A),질라 분석에서 돌연변이가 E3-결핍(도3B,배경 유비퀴틴화 신호만 검출됨)을 결정하였다.
E3 결핍 돌연변이체를 생성하고 생화학적으로 검증한 후, 기능성 연구는 시험된 RING E3 유비퀴틴 리가제의 E3 관련 생물학적 역할을 결정하도록 설계될 수 있다. RHA1B의 경우, 이 선충 이펙터는 Gpa2 트리거된 HR 세포 사멸의 억제에 의해 나타나는 식물 면역 신호를 억제합니다. 도4A에제시된 바와 같이, 야생형 RHA1B와 달리, RHA1BC135S 돌연변이체가 결여된 E3 리가제 활성은 HR 세포 사멸을 방해하지 않았다. 단백질 유비퀴틴화의 가장 흔한 결과는 프로테솜 매개 분해라는 점을 감안할 때, RING 도메인에 거주하는 돌연변이는 직접 및/또는 간접 기판의 분해를 유발하는 E3 의존적 능력을 확인하는 데 사용될 수 있습니다. 따라서, 그림 4B에서 서양 블로팅 결과는 Gpa2가 야생형 RHA1B의 존재에 축적되지 않았음을 확인하지만 RHA1BC135S는 Gpa2 단백질 안정성에 영향을 미치지 않았다.
그림 1: 사이트 지향 돌연변이 발생에 관여하는 원리 및 단계의 개략적 표현. (A)보존 된 Cys와 그의 아미노산강조와 링 CH / H2 도메인. (B)돌연변이 프라이머 디자인의 예. (C)사이트 지시 돌연변이 발생의 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 대표적인 시험관 내 유비퀴틴화 분석. (a)톱 겔은 모든 네거티브 대조군을 포함하는 유비퀴틴화 분석을 나타내고, 하단 겔은 동등한 하중을 나타낸다. (B)E2 효소에 따라 예상되는 결과의 범위. 이 그림은 Kud 외8에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 링-및 K-돌연변이체(RHA1BC135S 및 RHA1BK146R)에대한 유비퀴틴화 분석 결과. (A)RHA1BC135S 및 RHA1BK146R에대한 생체외 유비퀴틴화 결과. (B)RHA1BC135S 및 RHA1BK146R에대한 질라 유비퀴틴 분석 결과. 이 그림은 Kud 외8에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: E3 의존생물학적 기능에 대한 대표적인 기능적 연구. E3 의존생물학적 기능을 나타내는 기능성 연구의 예. (A)E3 의존성 HR 세포 사멸 억제 및(B)식물 면역수용체 Gpa2의 분해. 이 그림은 Kud 외8에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| PCR 설정 | |
| 1 μL | 플라스미드 (~100 ng) |
| 1.5 μL | F 돌연변이원 프라이머 (10 μM) |
| 1.5 μL | R 돌연변이원 프라이머 (10 μM) |
| 1 μL | DNTP (10 mM) |
| 5 μL | 버퍼(10x) |
| 1 μL | 울트라 푸 폴리머라제(2.5 U/μl) |
| 39 μL | ddH2O |
| 50 μL | 총 볼륨 |
표 1: PCR 반응 설정
| 열자전거 프로그램 | |||
| 1 | 95 °C | 30s | |
| 2 | 95 °C | 30s | |
| 3 | 60 °C | 30s | |
| 4 | 72 °C | 약 5분 | 2-4 30회 반복 |
| 5 | 72 °C | 약 5분 | |
표 2: PCR 열자전거 프로그램
| RHA1B 예제에 대한 결찰 반응 설정 | ||
| 1.5 μL | pMAL-c2::MBP BamHI와 살리 (60 ng)와 소화에 의해 선형화 벡터 | |
| 7 μL | 밤히와 살리로 소화된 RHA1B/RHA1BC135S 또는 RHA1BK146R 삽입체(25ng) | |
| 1 μL | T4 리가제 버퍼(10x) | |
| 0.5 μL | T4 리가제 (400 U /μL) | |
| 10 μL | 총 볼륨 | |
표 3: RHA1B 예시에 대해 설정된 결찰 반응.
Discussion
RING 타입 E3 유비퀴틴 리가제의 생화학적 및 기계적 기초를 설명하는 것은 개발, 스트레스 신호 및 항상성의 유지 보수에서 생물학적 중요성에 대한 우리의 이해에 크게 기여할 수 있습니다. 여기에 기술된 프로토콜은 시험관 내 및 질라 기능 연구에서 돌연변이 유발 접근법을 결합한다. 사이트 직접 돌연변이 발생을 통해 RING 도메인의 보존 된 잔류물에서 단일 아미노산 치환을 도입함으로써, 생성된 E3 결핍 돌연변이는 야생 형 단백질과 병행하여 효소 활성을 기능성과 연결하여 테스트 할 수 있습니다.
RING 도메인, 특히 보존된 Cys 및 그분의 잔류물을 적절히 식별하는 것이 중요합니다. PROSITE와 같은 온라인 도구를 사용하여10. E2 효소를 모집하는 RING 도메인을 불안정하게 하기 위해 Cys는 일반적으로 아연 협응에 사용되는 이황화물 결합을 생성할 수 없는 가장 가까운 구조적 대체품인 Ser로 대체됩니다. Lorick et al. 그 중요한 Cys 잔기 중 어느 하나에 있는 돌연변이가 단일 소단위 RING 형 E3 ligases5의유비퀴틴화 활성을 폐지할 것이라는 것을 보여주었다. 일부 Cys 잔기는 링형 단백질을 함유하는 다중 유닛 E3 리가아제 복합체에도 중요하지만, 그 유분질 복합체의 다각적이고 역동적인 3차원 구조로 인해 RING 형 단백질의 다른 역할, 다중 Unit E3 ligase에서 RING 도메인에서 보존된 잔류물의 단일 치환은 1리그아제 생성에 성공하지못했다.
사이트 지시 돌연변이 발생을 위해, 우리는 더 작은 플라스미드 벡터및 더 낮은 증폭 주기를 사용하여 일반적으로 돌연변이 발생을 위한 더 높은 효율성을 산출한다는 것을 것을을 발견했습니다. Pfu 효소는 다른 고충실도 및 높은 처리율 DNA 폴리머라제로 대체될 수 있다. 더욱이, 관심 있는 유전자가 희소한 코돈, 또 다른 대장균 얼룩, 로제타를 포함하는 경우, 재조합 단백질의 높은 수율을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 또한 IPTG 유도에 대한 인큐베이션 시간과 온도를 더욱 최적화할 수 있습니다. 낮은 온도는 특정 단백질의 표현에 유리할 지도 모르다 대장균 분열 비율을 감소시다. IPTG의 높은 농도 단백질 발현을 향상 시킬 수 있지만, 그것은 또한 억제 대장균 분열 프로세스 및 권장 하지 않습니다.
단일 소단위 RING 타입 E3 ligases는 기질에 근접하여 E2-Ub 중간체를 위치시키는 분자 스캐폴드로서 기능할 뿐만 아니라 동종 E2s의 유비퀴틴 전달 활성을 자극합니다. 더욱이, E2/E3 조합이 변형된 기판의 운명을 결정하는 폴리유비퀴틴 사슬의 길이 및 연계에 중요하다는 점을 감안할 때, RING 형 E3s의 모든 고려사항은 그들의 효소 파트너인 E2s12를포함해야 한다. 도 3B에도시된 바와 같이, 시험된 모든 E2가 RHA1B 리가제와 호환되는 것은 아니다. 따라서, 시험관 내 유비퀴틴화 분석법은 거짓 부정적인 결과를 피하기 위하여 다른 E2 클래스를 나타내는 다중 E2 효소와 병렬로 수행되어야 한다.
여기서 제시된 시험된 RING 형 단백질의 자가 유비퀴틴화 능력을 검출하는 체외 효소 분석입니다. 그러나, 작은 수정으로, 이 프로토콜은 기판의 시험관 내 유비퀴틴화를 검출하기 위해 용이하게 적응될 수 있다. 이를 위해, 단계 2.15로부터의 시험관내 유비퀴틴화 혼합물은 잠재적인 E3 리가아제 기질(500 ng)의 재조합 단백질로 보충되어야 한다. 30°C에서 2시간 배양한 후, 유비퀴틴화 단백질은 4°C에서 2시간 동안 교반하여 항HA 친화성 매트릭스(HA-Ub가 사용되는 경우 또는 FLAG-Ub가 사용되는 경우 항-FLAG 친화 매트릭스)의 15 μL을 사용하여 포획되어야 한다. 차가운 Ub 워시 버퍼(20 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.05% 트웬20, 1x PMSF)로 구슬을 4회 세척한 후, 완충액의 40 μL을 제외한 모든 것을 버리고 2.16단계로 이동한다. 에피토프 태그 Ub 및 기질에 특이적인 항체에 의해 검출된 유비퀴틴화 신호는 각각 기질 단백질의 분자량으로부터 방출되어 기질/효소 특이성을 확인한다.
더욱이, 생체 내에서 E3 리가제 기질의 식별은 일반적으로 과도 효소 기질 상호 작용 및 유비퀴틴화 표적 단백질의 급속한 분해로 인한 다중 도전과 연관된다. E3 리가제 결핍 돌연변이를 사용하여, 이는 여전히 그것의 표적과 상호 작용하지만 더 이상 유비퀴틴화13,항상 충분히 26S proteasome 기능을 방해하지 않는 proteasomal 억제제 MG132의 추가에 매우 유용한 대안이다.
RING 형 E3 리가제의 일반적인 특징은 호모 및 / 또는 이종으로 형성되고 기능하는 경향이있습니다. 흥미롭게도, RING 도메인의 보존된 잔류물에서의 치환은 일반적으로 돌연변이된 링형 E3 리가제블록의 토착 야생형단백질(13)의효소 활성을 차단하는 지배적인 음성 표현형과 연관된다. 따라서, 질라에서 RING 돌연변이체의 과발현은 E3 리가제 유전자를 노크하는 대안적인 접근법일 수 있다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리의 일은 USDA 국립 식량 농업 연구소, USDA-NIFA 농장 법안, 노스 웨스트 포테이토의 농업 및 식품 연구 이니셔티브 경쟁 보조금 (2017-67014-26197; 2017-67014-26591)의 재정 지원에 의해 가능하게되었다 컨소시엄, ISDA 특수 작물.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Amylose resin | NEB | E8021S | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
| Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
| Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
| Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
| Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
| E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
| FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
| FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
| Glucose | VWR | 188 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
| Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
| Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
| Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
| IPTG | Roche | 10724815001 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Liquide nitrogen | university chemistore | ||
| Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
| Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
| monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
| Mortar | VWR | 89038-144 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
| Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
| Pestle | VWR | 89038-160 | |
| Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
| Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
| pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
| Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| T4 ligase | NEB | M0202S |
References
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