Desreferência antibiótica usando a plataforma de resistência a antibióticos

Summary

Nós descrevemos uma plataforma que utilize uma biblioteca de Escherichia coli resistente antibiótico isogênicos para o desreplicação dos antibióticos. A identidade de um antibiótico produzido por bactérias ou fungos pode ser deduzada pelo crescimento de E. coli expressando seu respectivo gene de resistência. Esta plataforma é economicamente eficaz e tempo-eficiente.

Abstract

Um dos principais desafios na busca de novos antibióticos a partir de extratos de produtos naturais é a re-descoberta de compostos comuns. Para abordar esse desafio, a dereplicação, que é o processo de identificação de compostos conhecidos, é realizada em amostras de interesse. Os métodos de desreferência, como a separação analítica seguida por espectrometria de massas, são demorados e com uso intensivo de recursos. Para melhorar o processo de dereplicação, desenvolvemos a plataforma de resistência a antibióticos (ARP). O ARP é uma biblioteca de aproximadamente 100 genes da resistência antibiótica que foram clonados individualmente em Escherichia coli. Esta coleção de estirpe tem muitas aplicações, incluindo um método rentável e facile para a dereplicação de antibióticos. O processo envolve a fermentação de micróbios de produção de antibióticos na superfície de placas de Petri retangulares contendo meio sólido, permitindo assim a secreção e difusão de metabólitos secundários através do meio. Após um período de fermentação de 6 dias, a biomassa microbiana é removida e uma fina sobreposição de agar é adicionada à placa de Petri para criar uma superfície lisa e permitir o crescimento das cepas do indicador e. coli . Nossa coleção de cepas de ARP é fixada na superfície do prato de Petri contendo antibióticos. A placa é incubada em seguida durante a noite para permitir o crescimento de E. coli na superfície da sobreposição. Apenas cepas que contenham resistência a um antibiótico específico (ou classe) crescem nesta superfície, possibilitando a rápida identificação do composto produzido. Este método tem sido usado com sucesso para a identificação de produtores de antibióticos conhecidos e como um meio para identificar aqueles que produzem novos compostos.

Introduction

Desde a descoberta da penicilina em 1928, os produtos naturais derivados de microrganismos ambientais provaram ser uma fonte rica de compostos antimicrobianos¹. Aproximadamente 80% dos antibióticos do produto natural são derivados de bactérias do gênero Streptomyces e outros Actinomycetes, enquanto os 20% restantes são produzidos por espécies fúngicas¹. Alguns dos andaimes antibióticos mais comuns utilizados na clínica, como os β-lactams, tetraciclinas, rifamicinas e aminoglicosídeos, foram originalmente isolados de micróbios². No entanto, devido ao surgimento de bactérias multirresistent....

Protocol

1. preparação de E. coli biblioteca de estoques de glicerol (a partir de agar Slants)

1. Raia as cepas de ARP/MARP e. coli de inclinações de agar de caldo de lisogenia (lb) em placas de Petri contendo Agar lb e o marcador selecionável apropriado (tabela 1).
2. Prepare culturas para cada uma das cepas de E. coli inoculando 3 ml de lb contendo o marcador selecionável apropriado com uma única colônia. Cresça durante a noite em 37 ° c com aeração (250 rpm).
3. Combine 800 μL da cultura e 200 μL do glicerol estéril de 80% em um CryoVial de 1,8 mL. Misturar invertendo os tubos 3 − 4 vezes e conservar a-80 ° c.....

Results

Os seguintes resultados foram obtidos quando uma coleta de cepas produtoras de antibióticos de interesse foi desreferência utilizando o ARP e/ou MARP.

Um diagrama do fluxo de trabalho de dereplicação ARP/MARP é representado na Figura 1, e os mapas da placa de biblioteca são mostrados na figura 1 suplementar e na Figura 2 suplementar. A Figura 2 demonstra um resultado de dereplicação positiva em que o .......

Discussion

O protocolo descrito acima pode ser aplicado à descoberta de novos compostos antimicrobianos e adjuvantes que podem ser usados em conjunto com os antibióticos existentes para resgatar sua atividade. A plataforma aproveita a especificidade elevada da carcaça de mecanismos da resistência e de seus antibióticos cognato, aos compostos do dereplicate dentro dos extratos naturais crus do produto. Embora o tempo necessário para que as placas de desreferência sejam preparadas seja longa (~ 2 semanas), o processo de dereplicação .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Filmes para armazenamento a frio	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicilina Sal de Sódio	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Caldo (Ajustado a Cátions)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Carbonato de cálcio	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Aplicadores com ponta de algodão	Fisher Scientific	23-400-101
Tubo CryoPure 1,8 mL mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glicose	Bio Shop	GLU501.5
Tubo de Cultura Descartável, 16 mm x 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
Álcool Etílico Álcoois Comerciais Anidros		P016EAAN
Contas de Vidro, Sólido	Fisher Scientific	11-312C
Glicerol	Bio Shop	GLY001.4
Ácido Clorídrico	Fisher Scientific	A144-212
Fisher	Scientific	01-812-54
Sulfato de Ferro (II) Heptahidratado	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Sulfato de Canamicina	Bio Shop	KAN201.50
LB Caldo Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Sulfato de Magnésio Heptahidratado	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Filtro de Membrana, 0.45 µ m tamanho de poro	Millipore-Sigma	HAWP00010	rolo de 10 FT, hidrofílico, branco, simples
Placa Microtest 96 poços, base redonda	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova  44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Placa de Poço Único	Thermo Fisher Scientific	264728	com tampa, estéril, placa
Petri não tratada 92 mm x 16 mm com cames	Sarstedt	82.1473.001
Ferramentas de fixação	ETH Zurich-Pedido		personalizado
Cloreto de potássio	Fisher Scientific	P217-500
Amido de batata	Bulk Barn	279
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	BP358-10
Nitrato de sódio	Fisher Scientific	S343-500
Aplicadores de madeira	Dukal Corporation	9000
Extrato de levedura	Fisher Scientific	BP1422-2