Analysera mitokondriell transport och morfologi i mänskliga inducerad pluripotent stamcell-härledda nervceller i ärftliga spastisk paraplegi
Summary
Nedsatt mitokondriell transport och morfologi är involverade i olika neurodegenerativa sjukdomar. Det presenterade protokollet använder inducerad pluripotent stamcellshärledda förhjärnnervceller för att bedöma mitokondriell transport och morfologi i ärftliga spastic paraplegi. Detta protokoll möjliggör karakterisering av mitokondriell handel längs axoner och analys av deras morfologi, vilket kommer att underlätta studiet av neurodegenerativsjukdom.
Abstract
Nervceller har intensiva krav på hög energi för att stödja deras funktioner. Nedsatt mitokondriell transport längs axoner har observerats i mänskliga nervceller, vilket kan bidra till neurodegeneration i olika sjukdomstillstånd. Även om det är utmanande att undersöka mitokondriell dynamik i levande mänskliga nerver, sådana paradigm är avgörande för att studera den roll som mitokondrierna i neurodegeneration. Beskrivs här är ett protokoll för att analysera mitokondriell transport och mitokondriell morfologi i framhjärnan neuron axons härrör från mänskliga inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs). IPSCs är differentierade till telencephalic glutamatergic nervceller med hjälp av väletablerade metoder. Mitokondrierna av nervcellerna är färgade med MitoTracker CMXRos, och mitokondriell rörelse inom axonerna fångas med hjälp av en levande cell imaging mikroskop utrustad med en inkubator för cellkultur. Time-lapse bilder analyseras med hjälp av programvara med “MultiKymograph”, “Bioformat importör” och “Makron” plugins. Kymografier av mitokondriell transport genereras, och genomsnittlig mitokondriell hastighet i anterograde och bakåtsträvande riktningar läses från kymgrafen. När det gäller mitokondriell morfologi analys, mitokondriell längd, område och bildförhållande erhålls med hjälp av ImageJ. Sammanfattningsvis tillåter detta protokoll karakterisering av mitokondriell handel längs axoner och analys av deras morfologi för att underlätta studier av neurodegenerativa sjukdomar.
Introduction
Mitokondriellt motilitet och distribution spelar en viktig roll för att uppfylla varierande och specialiserade energiska krav i polariserade nervceller. Nervceller kan förlänga extremt långa axoner för att ansluta med mål genom bildandet av synapser, som kräver höga nivåer av energi för Ca2 + buffring och jonströmmar. Transport av mitokondrierna från soma till axon är avgörande för att stödja axonal och synaptisk funktion av nervceller. Rumsligt och tidsmässigt dynamisk mitokondriell rörelse utförs av snabb axonal transport till priser på flera mikrometer per sekund1.
Specifikt, motor eller adapter proteiner, såsom kinesin och dynein, delta i snabb organell transport längs mikrotubuli för att kontrollera förflyttning av mitokondrierna2,3. Normal neuronal aktivitet kräver korrekt transport av nymonterade mitokondrierna från neuronal soma till distala axon (anterograde axonal transport) och omvänd transport av mitokondrierna från distala axon tillbaka till cellkroppen (bakåtsträvande transport). Nyligen genomförda studier har visat att felaktig mitokondriell tilldelning är starkt förknippad med neuronala defekter och motor neuron degenerativa sjukdomar4,5. Därför, att dissekera rollen som mitokondrierna i neurodegeneration, är det viktigt att fastställa metoder för att undersöka mitokondriell rörelse längs axoner i levande kulturer.
Det finns två huvudsakliga utmaningar i att undersöka och analysera spårning av mitokondrierna: (1) identifiera mitokondrierna från bakgrunden i varje ram, och (2) analysera och generera anslutningar mellan varje ram. För att lösa den första utmaningen används en fluorescensmärkning sett till att skilja mitokondrierna från bakgrunden, såsom MitoTracker färgämne eller transfection av fluorescens-smält mitokondriellt inriktning protein (t.ex. mito-GFP)6,7,8. För att analysera sambandet mellan ramar har flera algoritmer och programvaruverktyg beskrivits i tidigare studier9. I en nyligen publicerad uppsats jämförde forskarna fyra olika automatiserade verktyg (t.ex. Volocity, Imaris, wrMTrck och Difference Tracker) med att kvantifiera mitokondriell transport. Resultaten visade att trots avvikelser i spårlängd, mitokondriell förskjutning, rörelselängd och hastighet, dessa automatiserade verktyg är lämpliga för utvärdering av transportskillnad efter behandling10. Förutom dessa verktyg, en integrerad plugin “Macros” för ImageJ (skriven av Rietdorf och Seitz) har använts ofta för att analysera mitokondriell transport11. Denna metod genererar kymografier som kan användas för att analysera mitokondriell rörelse, inklusive hastighet i både anterograde och bakåtsträvande riktningar.
Mitokondrierna är mycket dynamiska organeller som ständigt förändras i antal och morfologi som svar på både fysiologiska och patologiska tillstånd. Mitokondriell fission och fusion reglerar noggrant mitokondriell morfologi och homeostas. Obalansen mellan mitokondriell fission och fusion kan framkalla extremt korta eller långa mitokondriella nätverk, vilket kan försämra mitokondriell funktion och resultera i onormala neuronala aktiviteter och neurodegeneration. Nedsatt mitokondriell transport och morfologi är involverade i olika neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom och ärftliga spastic paraplegi (HSP)12,13,14,15. HSP är en heterogen grupp av ärftliga neurologiska sjukdomar som kännetecknas av degeneration av kortikospinal tarmkanalen och efterföljande underlåtenhet att kontrollera nedre extremitetsmusklerna16,17. I denna studie används iPSC-härledda förhjärnnervceller för att bedöma mitokondriell transport och morfologi i HSP. Denna metod ger ett unikt paradigm för att undersöka mitokondriell dynamik neuronal axons i levande kulturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna artikel beskriver en metod för att analysera mitokondriell transport och morfologi i neuronal axons med hjälp av rött fluorescerande färgämne och ImageJ programvara, som båda ger en unik plattform för att studera axonal degeneration och mitokondriell morfologi i neurodegenerativa sjukdomar. Det finns flera kritiska steg i protokollet, inklusive färgning av mitokondrierna, levande cell avbildning, och analysera bilderna. I denna metod användes ett fluorescerande färgämne för att färga mitokondrierna. Ef…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Spastic Parplegia Foundation, Blazer Foundation och NIH (R21NS109837).
Materials
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Biosafety hood | Thermo Scientific | 1300 SERIES A2 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R/ 75004261 | |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 | |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Dorsomorphin | Selleckchem | S7146 | |
| Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Corning | 10-092-CV | |
| FBS | Gibco | 16141-002 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | A1413201 | |
| Gem21 NeuroPlex Serum-Free Supplement | Gemini | 400-160 | |
| Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-0.170-14-C | |
| 9'' glass pipetes | VWR | 14673-043 | |
| Glial derived neurotrophic factor (BDNF) | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| GlutaMAX-I | Gibco | 35050-061 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | Invitrogen | M7512 | |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | A31815 | |
| Laminin | Sigma | L-6274 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-100ML | |
| MitoTracker CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| N2 NeuroPle Serum-Free Supplement | Gemini | 400-163 | |
| Olympus microscope IX83 | Olympus | IX83-ZDC2 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX41/ IX2-SLP | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| 24 well plates | Corning | 353047 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)) | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 | |
| Sterile 50ml Disposable Vacuum Filtration System 0.22 μm Millipore Express® Plus Membrane | Millipore | SCGP00525 | |
| Stericup 500/1000 ml Durapore 0.22 μM PVDF | Millipore | SCGVU10RE | |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 | |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075029 | |
| 50 ml tubes | Phenix | SS-PH50R | |
| 15 ml tubes | Phenix | SS-PH15R | |
| T25 flasks (untreated) | VWR | 10861-572 | |
| Plugins for softwares | |||
| Bio-formats Package | http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/5.1.0/ | ||
| Fiji software | https://fiji.sc/ | ||
| Kymograph Plugin | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleKymograph.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| MultipleOverlay.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| WalkingAverage.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| StackDifference.class | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html | ||
| Straighten_.jar | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/straighten.html | ||
| tsp050706.txt | https://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html |
References
- Brown, A. Axonal transport of membranous and nonmembranous cargoes: a unified perspective. Journal of Cell Biology. 160 (6), 817-821 (2003).
- Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. The Journal of Cell Biology. 131 (5), 1315-1326 (1995).
- Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (6), (2013).
- Magrane, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23 (6), 1413-1424 (2014).
- Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
- Wang, X., Schwarz, T. L. Imaging axonal transport of mitochondria. Methods in Enzymology. 457, 319-333 (2009).
- Course, M. M., et al. Live Imaging Mitochondrial Transport in Neurons. Neuromethods. 123, 49-66 (2017).
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with fluorescent dyes for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (6), 4948 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Bros, H., Hauser, A., Paul, F., Niesner, R., Infante-Duarte, C. Assessing Mitochondrial Movement Within Neurons: Manual Versus Automated Tracking Methods. Traffic. 16 (8), 906-917 (2015).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
- Denton, K., et al. Impaired mitochondrial dynamics underlie axonal defects in hereditary spastic paraplegias. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2517-2530 (2018).
- Kim-Han, J. S., Antenor-Dorsey, J. A., O’Malley, K. L. The parkinsonian mimetic, MPP+, specifically impairs mitochondrial transport in dopamine axons. Journal of Neuroscience. 31 (19), 7212-7221 (2011).
- Shirendeb, U. P., et al. Mutant huntingtin’s interaction with mitochondrial protein Drp1 impairs mitochondrial biogenesis and causes defective axonal transport and synaptic degeneration in Huntington’s disease. Human Molecular Genetics. 21 (2), 406-420 (2012).
- Lo Giudice, T., Lombardi, F., Santorelli, F. M., Kawarai, T., Orlacchio, A. Hereditary spastic paraplegia: clinical-genetic characteristics and evolving molecular mechanisms. Experimental Neurology. 261, 518-539 (2014).
- Blackstone, C. Cellular pathways of hereditary spastic paraplegia. Annual Review of Neuroscience. 35, 25-47 (2012).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), e50321 (2013).
- Zhu, P. P., Denton, K. R., Pierson, T. M., Li, X. J., Blackstone, C. Pharmacologic rescue of axon growth defects in a human iPSC model of hereditary spastic paraplegia SPG3A. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5638-5648 (2014).
- Marra, M. H., Tobias, Z. J., Cohen, H. R., Glover, G., Weissman, T. A. In Vivo Time-Lapse Imaging in the Zebrafish Lateral Line: A Flexible, Open-Ended Research Project for an Undergraduate Neurobiology Laboratory Course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 13 (3), 215-224 (2015).
- Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
- Mou, Y., Li, X. J. Rescue axonal defects by targeting mitochondrial dynamics in hereditary spastic paraplegias. Neural Regeneration Research. 14 (4), 574-577 (2019).
- Huang, S., et al. New photostable naphthalimide-based fluorescent probe for mitochondrial imaging and tracking. Biosensors & Bioelectronics. 71, 313-321 (2015).
- Carvalho, P. H., et al. Designed benzothiadiazole fluorophores for selective mitochondrial imaging and dynamics. Chemistry. 20 (47), 15360-15374 (2014).
- Yamakoshi, H., et al. A sensitive and specific Raman probe based on bisarylbutadiyne for live cell imaging of mitochondria. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (3), 664-667 (2015).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Chen, M., et al. A new method for quantifying mitochondrial axonal transport. Protein & Cell. 7 (11), 804-819 (2016).
- De Vos, K. J., Sheetz, M. P. Visualization and quantification of mitochondrial dynamics in living animal cells. Methods in Cell Biology. 80, 627-682 (2007).
- Denton, K. R., Xu, C. C., Li, X. J. Modeling Axonal Phenotypes with Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1353, 309-321 (2016).
- Andrews, S., Gilley, J., Coleman, M. P. Difference Tracker: ImageJ plugins for fully automated analysis of multiple axonal transport parameters. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 281-287 (2010).
- Reis, G. F., et al. Molecular motor function in axonal transport in vivo probed by genetic and computational analysis in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 23 (9), 1700-1714 (2012).
- Broeke, J. H., et al. Automated quantification of cellular traffic in living cells. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 378-384 (2009).
- Welzel, O., Knorr, J., Stroebel, A. M., Kornhuber, J., Groemer, T. W. A fast and robust method for automated analysis of axonal transport. European Biophysics Journal : EBJ. 40 (9), 1061-1069 (2011).
- Mukherjee, A., et al. Automated kymograph analysis for profiling axonal transport of secretory granules. Medical Image Analysis. 15 (3), 354-367 (2011).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays monitoring autophagy. Autophagy. 12, 1 (2016).
- Metivier, D., et al. Cytofluorometric detection of mitochondrial alterations in early CD95/Fas/APO-1-triggered apoptosis of Jurkat T lymphoma cells. Comparison of seven mitochondrion-specific fluorochromes. Immunology Letters. 61 (2-3), 157-163 (1998).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Liu, X., Yang, L., Long, Q., Weaver, D., Hajnoczky, G. Choosing proper fluorescent dyes, proteins, and imaging techniques to study mitochondrial dynamics in mammalian cells. Biophysics Reports. 3 (4), 64-72 (2017).
- Zhou, B., Lin, M. Y., Sun, T., Knight, A. L., Sheng, Z. H. Characterization of mitochondrial transport in neurons. Methods in Enzymology. 547, 75-96 (2014).
