通过在空气-液体界面中暴露培养的人类肺细胞，评估空气中颗粒的急性吸入毒性
Summary
我们提供一个强大、可转移和预测性的体外暴露系统，通过在空气-液体界面（ALI）暴露培养的人类肺细胞来筛选和监测空气中的颗粒，其急性肺细胞毒性。
Abstract
在这里，我们提出了一个专门设计的模块化体外暴露系统，使在ALI培养的人类肺细胞均匀地暴露于气体，颗粒或复杂的大气（如香烟烟雾），从而提供现实的生理人类阿尔皮拉尔区域的表层暴露在空气中。与采用线性气溶胶制导的连续曝光模型相比，径向流系统的模块化设计满足测试大气连续生成和输送到电池的所有要求，均匀分布和沉积粒子和大气的连续去除。这种接触方法主要设计用于细胞暴露于空气中的颗粒，但可以适应液体气溶胶和剧毒和腐蚀性气体的暴露，具体取决于气溶胶生成方法和接触模块的材料.
在最近完成的验证研究框架内，该暴露系统被证明是一种可转移、可重复和预测性筛选方法，用于对空气中颗粒的急性肺细胞毒性进行定性评估，从而可能减少或取代通常提供这种毒理学评估的动物实验。
Introduction
吸入有毒的空气中颗粒是一个公共卫生问题，导致世界各地的多种健康风险，每年有数百万人死亡。气候变化、持续的工业发展以及对能源、农业和消费品的需求增加，使得近年来肺病的增多是3、4、5、6。对可吸入物质的急性吸入毒性的认识和评估为危害评估和风险管理提供了依据，但这类物质种类繁多，7、8仍然缺乏这方面的信息。自 2006 年以来，欧盟化学品立法 REACH（化学品注册、评估、授权和限制）要求现有和新引进的产品在投放市场之前，必须经过毒理学特征，包括吸入途径。因此，REACH侧重于替代和无动物的方法，实现”3R”原则（替换，细化和减少动物实验）和使用适当的体外模型9。近年来，为了评估空气中颗粒5、7、10、11的急性吸入毒性，已经开发出许多不同的和适当的非动物吸入毒性测试模型（例如体外细胞培养、片上肺模型、精密切肺切片（PCLS）。）。在体外细胞培养模型方面，培养的细胞可以在水下条件下或ALI（图1）中暴露。然而，在评价空气中化合物特别是颗粒的毒性方面，水下暴露研究的有效性是有限的。水下接触技术与人体体内情况不符;覆盖细胞的细胞培养基可能影响物理化学性质，从而影响测试物质12、13的毒性。ALI体外吸入模型允许细胞直接暴露于测试物质，不受细胞培养基与测试颗粒的干扰，从而模仿人类接触，比水下暴露12、14具有更高的生理和生物相似性。
然而，对于REACH等监管过程，急性吸入毒理学领域只有动物模型可用，因为迄今为止，还没有一种替代的体外方法得到充分的验证和正式接受。为此，测试模型必须根据欧盟动物试验替代实验室（EURL-ECVAM）原则的要求对测试有效性15进行验证。
以前的审前研究和最近完成的验证研究成功地证明了CULTEX RFS暴露系统的应用领域及其可转移性、稳定性和可重复性13。该暴露系统是一种基于体外细胞的暴露系统，由于其径向气溶胶分布概念和测试气溶胶在细胞16的连续流动中连续流动，使细胞能够均匀地暴露在ALI的气体、颗粒或复杂大气（如香烟烟雾）中。该径向流系统的基本模块包括入口适配器、带径向气溶胶分布的气溶胶导向模块、采样和插座模块以及带手轮的锁定模块（图 2）。生成的颗粒通过入口适配器和气溶胶引导模块到达细胞，并沉积在细胞培养插件上，这些入口位于采样模块的三个径向排列的暴露室中。气溶胶导向模块和取样模块可以通过连接到外部水浴17进行加热。
在这两项研究的框架内，A549细胞被用于所有暴露实验。细胞系A549是一种人类不朽的上皮细胞系，其特征非常好，在众多毒理学研究中已被用作II型阿尔韦拉上皮细胞的体外模型。细胞的特点是乳腺体，生产表面活性剂和一些炎症相关因素18。它们还显示支气管上皮细胞的特性，由于其粘液生产19。此外，可以在 ALI 进行培养。虽然这种细胞系缺乏建立细胞-细胞接触，这些细胞的培养是更方便，成本更低，其结果与原细胞20相比与供体无关。
A549细胞被播种在6孔细胞培养插件（PET膜，4.67厘米2，孔径0.4毫米），密度为3.0 x105细胞每插件，并在水下条件下培养24小时。然后，在三个独立的实验室中，细胞暴露于清洁空气和三种不同的暴露剂量（25，50和100微克/厘米2）的20个测试物质在ALI。暴露剂量与沉积时间相关，导致在15、30或60分钟后，细胞的恒定颗粒速率为25微克/cm 2，50μg/cm2和100μg/cm2。 然而，沉积的颗粒在沉积后没有被冲走，而是留在细胞上24小时。因此，粒子的沉积时间为15、30和60分钟，但细胞的暴露总共持续了24小时。试验物质的沉积率是在初步实验中根据以往方法确定的。
使用细胞活力测定测定，在颗粒沉积后24小时评估细胞作为毒性指标的可毒性性。特别注重清洁空气控制的质量、暴露协议的优化和改进、实验室内和实验室间的可重复性以及建立预测模型（PM）。导致细胞活力下降低于 50% 的物质 （PM 50%）或 75%（PM 75%）在三种接触剂量中的任何一次都被认为具有急性吸入危险。结果然后比较现有的体内数据（根据经合组织测试指南（TG）403或TG 43621，22至少一项可靠的研究），导致整体协调度为85%，特异性为83%，灵敏度为88%23。
除了测量细胞活力外，还可以评估其他终点，如细胞因子释放、通过LDH测定检查细胞解酶或膜完整性，但验证研究不需要。因此，接触系统（例如，CULTEX RFS）被证明是一种预测性筛选系统，用于对被测试的空气颗粒的急性吸入毒性进行定性评估，是动物试验的一种有前途的替代方法。建议使用此曝光系统对空气中的颗粒进行暴露实验，建议采用以下方案。
Protocol
Representative Results
Discussion
近年来，为了获取有关可吸入颗粒物急性吸入危害的信息，并根据3R原理25减少和替换动物实验，开发了许多非动物吸入毒性试验模型。
在细胞培养模型方面，细胞的暴露可以在水下条件下或在ALI进行。在水下条件下暴露细胞可能会影响物理化学性质，从而影响测试物质12的毒性。然而，体外ALI吸入模型模拟了比水下暴露更高的生物和生理?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the German Federal Ministry of Education and Research (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Germany (Grant 031A581, sub-project A-D)) and by the German Research Foundation (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG,研究培训组 GRK 2338）。
Materials
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
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