הערכת הרעלת שאיפת חריפה של חלקיקי מוטס על ידי חשיפת תאי ריאה אנושיים בממשק האוויר-נוזלי
Summary
אנו מציגים חזקה, להעברה וניבוי מערכת חשיפה מחוץ למערכת להקרנה וניטור של חלקיקים מוטס בנוגע לרעילות חריפה של הריאות שלהם על ידי חשיפת מעובד בתאי הריאה האנושיים בממשק האוויר-נוזלי (ALI).
Abstract
כאן, אנו מציגים מודולרי מעוצב במיוחד במערכת חשיפה מחוץ לגוף המאפשרת חשיפה הומוגנית של תאי הריאה האנושיים מעובדים על ALI לגזים, חלקיקים או אטמוספרות מורכבות (למשל, עשן סיגריות), ובכך לספק פיסיולוגיים מציאותיים חשיפת המשטח האפיפיורי של האזור האנושי הכתשיים לאוויר. בניגוד מודלים חשיפה רציפים עם הדרכה תרסיס ליניארי, העיצוב המודולרי של מערכת הזרימה הרדיאלי עונה על כל הדרישות של הדור המתמשך והובלה של אווירת הבדיקה לתאים, התפלגות הומוגנית והפקדת את החלקיקים ואת ההסרה הרציפה של האטמוספירה. שיטת חשיפה זו מיועדת בעיקר לחשיפת תאים לחלקיקים מוטס, אך ניתן להתאים לחשיפה של אירוסולים נוזליים וגזים רעילים ואגרסיביים מאוד בהתאם לשיטת הדור התרסיס ולחומר של מודולי החשיפה .
במסגרת מחקר אימות שהושלם לאחרונה, מערכת חשיפה זו הוכחה כשיטת הקרנה להעברה, מוכחות וחזוי להערכת האיכות של רעילות הריאות חריפה של חלקיקים מוטס, ובכך שעלולים להפחית או להחליף ניסויים בבעלי חיים שבדרך כלל יספקו את ההערכה הטוקסיולוגית הזאת.
Introduction
האינהלציה של חלקיקים רעילים מוטס היא דאגה לבריאות הציבור, המובילה להמון סיכונים בריאותיים ברחבי העולם ומיליוני מקרי מוות מדי שנה1,2. שינוי האקלים, הפיתוח התעשייתי המתמשך והביקוש העולה לאנרגיה, מוצרי חקלאות וצרכן תרמו לגידול מחלות הריאות בשנים האחרונות3,4,5,6. ידע והערכה של חומרים הניתנים לאינהלציה בנוגע לרעילות האינהלציה החריפה שלהם, מספקים את הבסיס להערכת סיכונים ולניהול סיכוני, אך מידע זה עדיין חסר במגוון רחב של חומרים אלה7,8. מאז 2006, החקיקה הכימית של האיחוד האירופי (רישום, הערכה, מתן הרשאות והגבלת כימיקלים) דורשת שמוצרים קיימים וחדשים שכבר עוברים אפיון של הרעילות, כולל תוואי האינהלציה לפני ההנחה בשוק. לכן, הגעה מתמקדת בשיטות חלופיות וחופשיות לבעלי חיים, יישום העיקרון “3R” (החלפה, עידון והפחתה של ניסויים בבעלי חיים) והשימוש המתאים במודלים של חוץ גופית9. בשנים האחרונות, שונים והולמים שאינם בעלי חיים הרעלה רעילות מודלים (g., בתרביות תאים מחוץ למים, מודלים של ריאה על שבב, מדויק לגזור פרוסות ריאה (pcls)) פותחו על מנת להעריך את רעילות האינהלציה חריפה של חלקיקים מוטס5,7,10,11. במונחים של מודלים של תרבות תא מבחנה, תאים מעובדים ניתן לחשוף בתנאים מתחת לאור או ב-ALI (איור 1). עם זאת, את תוקפו של מחקרים חשיפה שקוע מוגבלת ביחס להערכת רעילות של תרכובות מוטס חלקיקים בעיקר. טכניקות חשיפה מתחת לגוף אינן מתאימות לאדם במצב vivo; המדיום של תרבות התא המכסה את התאים עלול להשפיע על המאפיינים פיזיקאלית-כימיים ולכן, את התכונות הרעילות של חומר מבחן12,13. עלי במודלים של שאיפת חוץ גופית מאפשרים חשיפה ישירה של תאים לחומרים בדיקה ללא הפרעה של מדיום התרבות התא עם חלקיקי מבחן, ובכך, מחקה את החשיפה האנושית עם דמיון פיזיולוגי וביולוגי גבוה יותר מאשר כיווני אויר12,14.
לתהליכים הרגולטורים כגון הגעה, לעומת זאת, רק דגמי בעלי חיים זמינים בתחום הרעלים החריפים, משום שאין אלטרנטיבה בשיטות החוץ-גופית שאושרו מספיק והתקבלו באופן רשמי עד כה14. לשם כך, יש לאמת את המודלים הבסיסיים בהתאם לדרישות המעבדה להתייחסות לאיחוד האירופי לחלופות לבדיקות בעלי חיים (EURL-ECVAM) על חוקיות הבדיקה15.
מחקר טרום-אימות לשעבר ומחקר אימות שהושלם לאחרונה הפגינו בהצלחה את אזור היישום של מערכת החשיפה CULTEX RFS ואת ההעברה, היציבות והיכולת להיות בלתי מנוצח13. מערכת חשיפה זו היא מערכת חשיפה מבוססת תא מחוץ למערכת המאפשרת חשיפה הומוגנית של תאים לגזים, חלקיקים או אטמוספרות מורכבות (למשל, עשן סיגריות) בבית עלי בשל קונספט הפצת התרסיס הרדיאלי שלה וההולכה של תרסיס הבדיקה בזרימה רציפה על התאים16. המודול הבסיסי של מערכת הזרימה הרדיאלי הזאת מורכב ממתאם האוויר, המודול המנחה את התרסיס עם התפלגות התרסיס הרדיאלי, מודול הדגימה והשקע, ומודול נעילה עם גלגל יד (איור 2). החלקיקים שנוצר להגיע לתאים באמצעות מתאם מפרץ ומודול המנחה תרסיס ומופקד על מוסיף תרבות התא, אשר ממוקמים בשלושה מסודרים רדיוally חדרי החשיפה של מודול הדגימה. המודול המנחה תרסיס, כמו גם מודול הדגימה יכול להיות מחומם על ידי התחברות לאמבטיה מים חיצוניים17.
במסגרת שני המחקרים, השתמשו בתאי A549 לכל ניסויי החשיפה. קו התא A549 הוא קו האפיתל מונצח האנושי כי הוא מאופיין היטב, שימש מודל בלתי מתורבת עבור סוג II מכתשיים האפיתל במחקרים רבים לאחר הרעילות. התאים מאופיינים בגופים מלוניים, הפקת חומרים מקצועיים ומספר גורמים הרלוונטיים לדלקת,18. הם גם מראים מאפיינים של תאים אפיתל ברונכיט בשל ייצור ריר שלהם19. יתר על כן, הם יכולים להיות מתורבתים ב-ALI. למרות שהקו הנייד הזה חסר בבניית קשרים סלולריים, הטיפוח של תאים אלה הוא הרבה יותר נוח, פחות עלות יקרה ותוצאות שנגזרות מהם אינן תלויות ביחס לתאים הראשוניים20.
A549 תאים שופרה בשנת 6-היטב התרבות תאים מוסיף (קרום PET, 4.67 ס מ2, הנקבוביות גודל 0.4 מ”מ) עם צפיפות של 3.0 x 105 תאים לכל הוספה ומעובד עבור 24 h תחת תנאים שקועים. תאים נחשפו לאחר מכן בשלוש מעבדות עצמאיות כדי לנקות אוויר ושלוש מינונים חשיפה שונים (25, 50, ו 100 μg/cm2) של 20 חומרי בדיקה ב-ALI. מינון החשיפה מתואם את זמן התצהיר וכתוצאה מכך שיעור חלקיקים קבוע של 25 μg/ס”מ2, 50 μg/cm2 ו 100 μg/cm2 על התאים לאחר 15, 30 או 60 min, בהתאמה. החלקיקים שהופקדו, לעומת זאת, לא נשטפו לאחר התצהיר, אך נשארו על התאים במשך 24 שעות. זמני התצהיר של החלקיקים היו אפוא 15, 30 ו 60 דקות, אבל החשיפה של התאים נמשך 24 h בסך הכל. שיעור התצהיר של חומרי הניסוי נקבע בניסויים ראשוניים על פי שיטות קודמות17.
באמצעות הכדאיות של התאים כאינדיקציה לרעילות הוערך 24 שעות לאחר תצהיר החלקיקים באמצעות שיטת הכדאיות של התא. מיקוד מיוחד הוגדר על איכות של בקרות אוויר נקי, אופטימיזציה ועידון של פרוטוקול החשיפה, מחדש הפנים והבין מעבדה ה, הקמת מודל חיזוי (PM). חומרים שהובילו לירידה של הכדאיות התאית מתחת 50% (PM 50%) או 75% (PM 75%) בכל אחת משלוש מנות החשיפה נחשבו לפגעי שאיפת חריפה. התוצאות הושוו לקיים בנתונים vivo (מבוסס על לפחות מחקר אמין אחד על פי מבחן ה-OECD מנחה (tg) 403 או tg 43621,22), המוביל לקונקורדנציה כוללת של 85%, עם ספציפיות של 83% ורגישות של 88%23.
מלבד המדידה של הכדאיות התא, נקודות קצה אחרות כגון שחרור ציטוקינים, בדיקת שלמות התא או ממברנה באמצעות שיטת ldh ניתן להעריך אך לא נדרשו עבור מחקר אימות. לפיכך, מערכת החשיפה (למשל, CULTEX RFS) הוכחה כמערכת סינון חזוי להערכה האיכותית של רעילות האינהלציה החריפה של החלקיקים המוטסים שנבדקו, המייצגים שיטה חלופית מבטיחה לניסויים בבעלי חיים. הפרוטוקול הבא מומלץ לניסויים בחשיפה לחלקיקים מוטס באמצעות מערכת חשיפה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים רבים של הרעלת שאיפת בעלי חיים לא פותחו בשנים האחרונות על מנת לקבל מידע על מפגעי האינהלציה החריפה של חלקיקי שאיפה ולהפחית ולהחליף ניסויים בבעלי חיים על פי עיקרון ה-3R25.
במונחים של מודלים של תרבות התא, חשיפה של תאים ניתן לבצע בתנאים מתחת לאור או ב-ALI. חשיפת הת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי משרד החינוך והמחקר הגרמני (Bundesministerium ger בילדונג ו Forschung, BMBF, גרמניה (גרנט 031A581, תת-פרוייקט A-D)) ועל ידי הקרן המחקר הגרמני (דויטשה פורשונגסגסםהסלבירכתיים, DFG, מחקר קבוצת הדרכה GRK 2338).
Materials
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
References
- Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
- De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
- LANUV Nordrhein-Westfalen. . Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
- Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
- Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
- Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
- Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
- Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
- Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
- Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
- Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
- Eskes, C., Whelan, M. . Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).
- Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
- Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
- Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
- Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
- OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).
- OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
- Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
- OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).
- OECD. . Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).
