एयर-लिक्विड इंटरफेस पर खेती मानव फेफड़ों की कोशिकाओं को उजागर करके हवाई कणों की तीव्र साँस लेना विषाक्तता का आकलन
Summary
हम एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) में खेती की मानव फेफड़ों की कोशिकाओं को उजागर करके उनके तीव्र फेफड़े के साइटोटॉक्सिकता से संबंधित हवाई कणों की स्क्रीनिंग और निगरानी के लिए एक मजबूत, हस्तांतरणीय और भविष्य कहनेवाला इन विट्रो एक्सपोजर सिस्टम पेश करते हैं।
Abstract
यहां, हम एक विशेष रूप से डिजाइन मॉड्यूलर इन विट्रो एक्सपोजर सिस्टम पेश करते हैं जो अली में खेती की गई मानव फेफड़ों की कोशिकाओं के समरूप जोखिम को गैसों, कणों या जटिल वायुमंडल (जैसे, सिगरेट का धुआं) में सक्षम बनाता है, इस प्रकार यथार्थवादी शारीरिक प्रदान करता है मानव अल्वेलर क्षेत्र की एपिकल सतह का हवा में जोखिम। रैखिक एयरोसोल मार्गदर्शन के साथ अनुक्रमिक एक्सपोजर मॉडल के विपरीत, रेडियल प्रवाह प्रणाली का मॉड्यूलर डिजाइन कोशिकाओं के लिए परीक्षण वातावरण की निरंतर पीढ़ी और परिवहन के लिए सभी आवश्यकताओं को पूरा करता है, एक समरूप वितरण और जमाव कण और वातावरण को लगातार दूर करना। यह एक्सपोजर विधि मुख्य रूप से हवाई कणों के लिए कोशिकाओं के जोखिम के लिए डिज़ाइन की गई है, लेकिन एयरोसोल उत्पादन विधि और एक्सपोजर मॉड्यूल की सामग्री के आधार पर तरल एयरोसोल और अत्यधिक विषाक्त और आक्रामक गैसों के संपर्क में आड्ड किया जा सकता है .
हाल ही में पूरा सत्यापन अध्ययन के ढांचे के भीतर, यह एक्सपोजर सिस्टम हवाई कणों की तीव्र फेफड़े के साइटोटॉक्सिकता के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए एक हस्तांतरणीय, प्रजनन योग्य और भविष्य कहनेवाला स्क्रीनिंग विधि के रूप में साबित हुआ था, जिससे संभावित रूप से पशु प्रयोगों को कम करना या प्रतिस्थापित करना जो आम तौर पर इस विषविज्ञानी आकलन प्रदान करेगा।
Introduction
जहरीले हवाई कणों का साँस लेना एक सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय है, जिससे दुनिया भर में स्वास्थ्य जोखिमों की एक भीड़ और सालाना कई लाखों मौतें1,2। जलवायु परिवर्तन, चल रहे औद्योगिक विकास और ऊर्जा, कृषि और उपभोक्ता उत्पादों की बढ़ती मांग ने पिछलेवर्षोंमें फेफड़े की बीमारियों को बढ़ाने में योगदान दिया है । उनकी तीव्र साँस लेना विषाक्तता के बारे में साँस लेने योग्य पदार्थों का ज्ञान और मूल्यांकन जोखिम मूल्यांकन और जोखिम प्रबंधन का आधार प्रदान करता है, लेकिन यह जानकारी अभी भी इनपदार्थोंकी एक विस्तृत श्रृंखला के लिए7,8की कमी है । २००६ के बाद से, यूरोपीय संघ के रासायनिक कानून पहुंच (पंजीकरण, मूल्यांकन, प्राधिकरण और रसायनों के प्रतिबंध) की आवश्यकता है कि पहले से ही मौजूदा और नए शुरू उत्पादों को बाजार पर रखा जा रहा से पहले साँस लेना मार्ग सहित एक विषविज्ञानी लक्षण वर्णन से गुजरना । इसलिए, रीच वैकल्पिक और पशु मुक्त तरीकों, “3आर” सिद्धांत (प्रतिस्थापन, शोधन और पशु प्रयोगों में कमी) के कार्यान्वयन और उपयुक्त इन विट्रो मॉडल9का उपयोग पर केंद्रित है। हाल के वर्षों में, कई अलग और पर्याप्त गैर पशु साँस लेना विषाक्तता परीक्षण मॉडल (जैसे, इन विट्रो सेल संस्कृतियों, फेफड़ों पर एक चिप मॉडल, सटीक कट फेफड़ों के स्लाइस (PCLS)) का आकलन करने के लिए हवाई कणों की तीव्र साँस लेना विषाक्तताकाआकलन करने के लिए विकसित किया गया है5,7,10,11। इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल के संदर्भ में, खेती की कोशिकाओं को जलमग्न परिस्थितियों में या अली(चित्रा 1)में उजागर किया जा सकता है। हालांकि, जलमग्न एक्सपोजर अध्ययनों की वैधता हवाई यौगिकों विशेष रूप से कणों की विषाक्तता के मूल्यांकन के संबंध में सीमित है । जलमग्न एक्सपोजर तकनीक वीवो स्थिति में मानव के अनुरूप नहीं है; कोशिकाओं को कवर करने वाला सेल कल्चर मीडियम फिजीको-रासायनिक गुणों को प्रभावित कर सकता है और इस प्रकार, एक परीक्षण पदार्थ के जहरीले गुण12,13। अली इन विट्रो साँस लेना मॉडल परीक्षण कणों के साथ कोशिका संस्कृति माध्यम के हस्तक्षेप के बिना परीक्षण पदार्थों के लिए कोशिकाओं के प्रत्यक्ष जोखिम की अनुमति है, इस प्रकार, जलमग्न जोखिम12,14की तुलना में उच्च शारीरिक और जैविक समानता के साथ मानव जोखिम नकल उतार ।
हालांकि, रीच जैसी नियामक प्रक्रियाओं के लिए, तीव्र साँस लेना विष विज्ञान के क्षेत्र में केवल पशु मॉडल उपलब्ध हैं, क्योंकि विट्रो विधियों में कोई विकल्प पर्याप्त रूप से मान्य नहीं किया गया है और आधिकारिक तौर पर अब तक14को स्वीकार नहीं किया गया है। इस उद्देश्य के लिए, परीक्षण मॉडल को परीक्षण वैधता15पर पशु परीक्षण के विकल्प के विकल्प के लिए यूरोपीय संघ संदर्भ प्रयोगशाला (EURL-ECVAM) सिद्धांतों की आवश्यकताओं के अनुसार मान्य किया जाना है ।
एक पूर्व पूर्व सत्यापन अध्ययन और हाल ही में पूरा सत्यापन अध्ययन सफलतापूर्वक CULTEX RFS जोखिम प्रणाली और इसकी हस्तांतरणीयता, स्थिरता, और प्रजननक्षमता 13के आवेदन क्षेत्र का प्रदर्शन किया । यह एक्सपोजर सिस्टम एक इन विट्रो सेल-आधारित एक्सपोजर सिस्टम है जो अपनी रेडियल एयरोसोल वितरण अवधारणा और कोशिकाओं16पर निरंतर प्रवाह में परीक्षण एयरोसोल के चालन के कारण अली में गैसों, कणों या जटिल वायुमंडल (जैसे, सिगरेट का धुआं) कोशिकाओं के समरूप जोखिम को सक्षम बनाता है। इस रेडियल फ्लो सिस्टम के मूल मॉड्यूल में इनलेट एडाप्टर, रेडियल एयरोसोल वितरण के साथ एयरोसोल गाइडिंग मॉड्यूल, नमूना और सॉकेट मॉड्यूल, और हैंड व्हील(चित्रा 2)के साथ लॉकिंग मॉड्यूल शामिल है। उत्पन्न कण इनलेट एडाप्टर और एयरोसोल मार्गदर्शक मॉड्यूल के माध्यम से कोशिकाओं तक पहुंचते हैं और सेल संस्कृति आवेषण पर जमा होते हैं, जो नमूना मॉड्यूल के तीन रेडियल व्यवस्थित एक्सपोजर कक्षों में स्थित होते हैं। एयरोसोल गाइडिंग मॉड्यूल के साथ – साथ सैंपलिंग मॉड्यूल को बाहरी पानी के स्नान17से जोड़कर गर्म किया जा सकता है ।
दोनों अध्ययनों के ढांचे के भीतर, A549 कोशिकाओं का उपयोग सभी एक्सपोजर प्रयोगों के लिए किया गया था। सेल लाइन A549 एक मानव अमर एपीथेलियल सेल लाइन है जो बहुत अच्छी तरह से विशेषता है और कई विषविज्ञानी अध्ययनों में टाइप II अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में उपयोग किया गया है। कोशिकाओं को लैमेलर निकायों, सर्फेक्टेंट का उत्पादन और सूजन-प्रासंगिक कारकों की एक संख्या18द्वारा विशेषता है । वे अपने बलगम उत्पादन19के कारण ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं के गुण भी दिखाते हैं । इसके अलावा, वे अली में संस्कारित किया जा सकता है । यद्यपि इस सेल लाइन में सेल-सेल संपर्कों के निर्माण में कमी है, लेकिन इन कोशिकाओं की खेती बहुत अधिक सुविधाजनक है, कम लागत महंगी है और इसके प्राप्त परिणाम प्राथमिक कोशिकाओं20की तुलना में दाता-स्वतंत्र हैं।
A549 कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से सेल कल्चर आवेषण (पीईटी झिल्ली, 4.67 सेमी2,पोर आकार 0.4 मिमी) में वरीयता प्राप्त की गई थी, जिसमें 3.0 x 105 कोशिकाओं प्रति डालने का घनत्व था और जलमग्न परिस्थितियों में 24 घंटे के लिए खेती की गई थी। कोशिकाओं को तो तीन स्वतंत्र प्रयोगशालाओं में उजागर करने के लिए हवा साफ और तीन अलग जोखिम खुराक (25, ५०, और १०० μg/सेमी2)अली में 20 परीक्षण पदार्थों की । एक्सपोजर खुराक जमाव समय से सहसंबद्ध होती है जिसके परिणामस्वरूप क्रमशः 15, 30 या ६० मिन के बाद कोशिकाओं पर 25 μg/cm2,५० μg/cm2 और १०० μg/सेमी2 की लगातार कण दर होती है । जमा कणों, हालांकि, बयान के बाद नहीं धोया गया था, लेकिन 24 घंटे के लिए कोशिकाओं पर बने रहे । कणों के बयान समय इसलिए 15, 30 और ६० मिन थे, लेकिन कोशिकाओं के जोखिम कुल में 24 घंटे के लिए चली । परीक्षण पदार्थों की जमाव दर पिछले तरीकों के अनुसार प्रारंभिक प्रयोगों में निर्धारित की गई थी17.
विषाक्तता के एक संकेतक के रूप में सेल व्यवहार्यता एक सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग कर कण बयान के बाद 24 घंटे का आकलन किया गया था । स्वच्छ वायु नियंत्रण की गुणवत्ता, एक्सपोजर प्रोटोकॉल के अनुकूलन और शोधन, अंतर और अंतर-प्रयोगशाला प्रजनन क्षमता और एक भविष्यवाणी मॉडल (पीएम) की स्थापना पर विशेष ध्यान केंद्रित किया गया था। पदार्थ है कि ५०% से नीचे सेल व्यवहार्यता की कमी के लिए नेतृत्व (प्रधानमंत्री ५०%) या 75% (पीएम 75%) तीन एक्सपोजर खुराकों में से किसी में एक तीव्र साँस लेना खतरा लागू करने के लिए माना जाता था। परिणाम तब वीवो डेटा में मौजूदा की तुलना में थे (ओईसीडी परीक्षण दिशानिर्देश (टीजी) 403 या टीजी 43621,22के अनुसार कम से कम एक विश्वसनीय अध्ययन के आधार पर, 83% की विशिष्टता और 88%23की संवेदनशीलता के साथ 85% का समग्र सामंजस्य होता है।
सेल व्यवहार्यता के माप के अलावा, साइटोकिन रिलीज जैसे अन्य अंत बिंदुओं, एलडीएच परख के माध्यम से सेल लाइसेट या झिल्ली अखंडता की जांच का मूल्यांकन किया जा सकता है लेकिन सत्यापन अध्ययन के लिए आवश्यक नहीं थे। इस प्रकार, एक्सपोजर सिस्टम (उदाहरण के लिए, CULTEX आरएफएस) परीक्षण किए गए हवाई कणों की तीव्र साँस लेना विषाक्तता के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए एक भविष्य कहनेवाला स्क्रीनिंग प्रणाली के रूप में साबित हुआ, जो पशु परीक्षण के लिए एक आशाजनक वैकल्पिक विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इस एक्सपोजर सिस्टम का उपयोग करके हवाई कणों के संपर्क प्रयोगों के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल की सिफारिश की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हाल के वर्षों में साँस लेने योग्य कणों के तीव्र साँस लेने के खतरे के बारे में जानकारी प्राप्त करने और 3आर सिद्धांत25के अनुसार पशु प्रयोगों को कम करने और प्रतिस्थापित करने के लिए कई गैर-पशु साँस ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री ऑफ एजुकेशन एंड रिसर्च (बुंदेसियम फ्यूर बिलडुंग एंड फोर्सचुंग, बीएमबीएफ, जर्मनी (ग्रांट 031A581, सब-प्रोजेक्ट ए-डी) और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (ड्यूश फोर्सचुंग्सेस्चेफ्ट, डीएफजी) द्वारा समर्थित किया गया था, अनुसंधान प्रशिक्षण समूह GRK 2338)।
Materials
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
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