공기-액체 인터페이스에서 재배된 인간 폐 세포를 노출하여 공기 중 입자의 급성 흡입 독성 평가
Summary
우리는 공기 액체 인터페이스 (ALI)에서 경작 된 인간 폐 세포를 노출시킴으로써 급성 폐 세포 독성에 관한 공기 중 입자의 스크리닝 및 모니터링을위한 견고하고 양도 가능하며 예측 가능한 체외 노출 시스템을 제시합니다.
Abstract
여기에서, 우리는 ALI에서 재배된 인간 폐 세포의 균질한 노출을 가스, 입자 또는 복잡한 대기(예: 담배 연기)에 균질하게 노출할 수 있도록 특별히 설계된 시험관 내 노출 시스템을 제시하여 현실적인 생리학적 인 생리학적 을 제공합니다. 공기에 인간 폐포 영역의 정점 표면의 노출. 선형 에어로졸 가이던스가 있는 순차적 노광 모델과 는 달리, 방사형 유량 계통의 모듈식 설계는 테스트 분위기의 연속 생성 및 세포 수송, 균질한 분포 및 증착에 대한 모든 요구 사항을 충족합니다. 입자와 대기의 지속적인 제거. 이 노출 방법은 주로 공기 중 입자에 세포의 노출을 위해 설계, 하지만 에어로졸 생성 방법 및 노출 모듈의 재료에 따라 액체 에어로졸 및 매우 독성및 공격적인 가스의 노출에 적응 될 수있다 .
최근 완료된 검증 연구의 틀 안에서, 이 노출 시스템은 공기 중 입자의 급성 폐 세포 독성의 질적 평가를 위한 양도 가능, 재현 가능 및 예측 스크리닝 방법으로 입증되었으며, 이에 따라 잠재적으로 감소 또는 일반적으로이 독성 평가를 제공 하는 동물 실험을 대체.
Introduction
유독한 공기 중 입자의 흡입은 공중 위생 관심사, 전 세계적으로 건강 위험의 다수로 이끌어 내고 죽음의 많은 수백만 매년1,2. 기후변화, 지속적인 산업발전, 에너지, 농산물 및 소비재에 대한 수요 증가는 지난 몇 년간폐질환의증가에 기여해 왔으며3, 4,5,6. 그들의 급성 흡입 독성에 관한 흡입 성 물질의 지식과 평가는 위험 평가 및 위험 관리의 기초를 제공하지만,이 정보는 여전히 이러한 물질의 넓은 범위에 대한 부족7,8. 2006년부터 EU 화학 법규 REACH(화학물질등록, 평가, 승인 및 제한)는 기존 및 새로 도입된 제품이 시장에 출시되기 전에 흡입 경로를 포함한 독성 특성화를 거쳐야 합니다. 따라서 REACH는 대체 및 동물 없는 방법, “3R” 원리의 구현(동물 실험의 대체, 정제 및 감소) 및 적절한 시험관 내 모델의 사용에 초점을 맞추고9. 최근 몇 년 동안, 많은 상이하고 적절한 비동물 흡입 독성 시험 모델(예를 들어, 시험관 내 세포 배양, 폐온칩 모델, 정밀 절단 폐 슬라이스(PCLS))은 공기 중 입자의 급성 흡입 독성을 평가하기 위해 개발되어5,7,10,11. 시험관 내 세포 배양 모델의 관점에서, 경작된 세포는 침수된 조건 하에서 또는 ALI에서 노출될 수있다(도 1). 그러나, 침수 된 노출 연구의 타당성은 공기 중 화합물 특히 입자의 독성평가에 관하여 제한된다. 침수 된 노출 기술은 생체 내 인간 상황에 부합하지 않습니다; 세포를 덮는 세포 배양 배지는 물리-화학적 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서, 시험물질(12,13)의독성 성질을 갖는다. ALI 체외 흡입 모델은 시험 입자와 세포 배양 배지의 간섭없이 시험 물질에 세포의 직접 노출을 허용, 따라서, 침수 노출보다 더 높은 생리적 및 생물학적 유사성을 가진 인간의 노출을 모방12,14.
REACH와 같은 규제 프로세스의 경우, 급성 흡입 독성학 분야에서 동물 모델만 사용할 수 있으며, 시험관 내 대안이 충분히 검증되지 않았고 지금까지14. 이를 위해, 시험 모델은 시험 타당성에 대한 유럽 연합 참조 연구소의 동물 실험 대안(EURL-ECVAM) 원칙에 따라 검증되어야 합니다15.
이전 사전 검증 연구 및 최근 완료 된 검증 연구는 성공적으로 CULTEX RFS 노출 시스템의 적용 영역과 그 전송성, 안정성 및 재현성13을입증했다. 이러한 노출 시스템은 그 방사형 에어로졸 분포 개념 및 시험 에어로졸의 전도로 인해 ALI에서 가스, 입자 또는 복잡한 대기(예를 들어, 담배 연기)에 세포의 균질한 노출을 가능하게 하는 시험관내 세포 기반 노출시스템(16)을통해 연속적인 흐름으로. 이 방사형 유량 시스템의 기본 모듈은 인렛 어댑터, 방사형 에어로졸 분포가 있는 에어로졸 가이딩 모듈, 샘플링 및 소켓 모듈, 핸드 휠이 있는 잠금 모듈로구성됩니다(그림 2). 생성된 입자는 인렛 어댑터 및 에어로졸 가이딩 모듈을 통해 세포에 도달하고 샘플링 모듈의 3개의 방사형 배치된 노출 챔버에 위치한 세포 배양 인서트상에 증착된다. 에어로졸 가이딩 모듈과 샘플링 모듈은 외부수조(17)에연결하여 가열할 수 있다.
두 연구의 틀 내에서, A549 세포는 모든 노출 실험에 사용되었다. 상기 세포주 A549는 인간 불멸의 상피 세포주로서 매우 잘 특성화되어 수많은 독성 연구에서 II형 폐포 상피 세포에 대한 시험관내 모델로 사용되어 왔다. 상기 세포는 라멜라 체, 계면활성제 및 다수의 염증 관련인자(18)의생산을 특징으로 한다. 그(것)들은 또한 그들의 점액 생산19때문에 기관지 상피 세포의 속성을 보여줍니다. 또한 ALI에서 배양할 수 있습니다. 이러한 세포주들은 세포-세포 접촉을 구축하는데 결핍되어 있지만, 이들 세포의 배양은 훨씬 더 편리하고, 비용이 적게 들고, 이의 유래 된 결과는 1차세포(20)에비해 공여자-독립적이다.
A549 세포를 삽입당 3.0 x 105 세포의 밀도로 6웰 세포 배양 인서트(PET 멤브레인, 4.67 cm2,기공 크기 0.4 mm)에서 시드하고 24시간 동안 침수된 조건에서 배양하였다. 세포는 공기를 청소하기 위해 3 개의 독립적 인 실험실에서 노출된 후 ALI에서 20 개의 시험 물질 중 3 가지 노출 용량 (25, 50 및 100 μg / cm2)을노출했습니다. 노출 량은 각각 15, 30 또는 60 분 후에 세포에 25 μg/cm2,50 μg/cm2 및 100 μg/cm2의 일정한 입자 비율의 결과로 증착 시간과 상관됩니다. 증착된 입자는, 그러나, 증착 후에 떨어져 세척되지 않았습니다, 그러나 24 시간 동안 세포에 남아 있었습니다. 입자의 증착 시간은 따라서 15, 30 및 60 분이었지만 세포의 노출은 총 24 시간 동안 지속되었습니다. 시험 물질의 증착 속도는 이전 방법17에따른 예비 실험에서 결정되었다.
세포 생존력의 지표로서 세포 생존력은 세포 생존성 분석기를 사용하여 입자 증착 후 24시간 평가되었다. 특히 청정 공기 제어의 품질, 노출 프로토콜의 최적화 및 개선, 실험실 내 재현성 및 예측 모델(PM)의 확립에 중점을 두였습니다. 세포 생존율 50% 이하(PM 50%) 감소를 초래한 물질 또는 75% (PM 75%) 3개의 노출 복용량 중 어느 에서든 급성 흡입 위험을 발휘하는 것으로 간주되었다. 그 후 생체내 데이터(OECD 테스트 가이드라인(TG) 403 또는 TG 43621,22에따른 최소 하나의 신뢰할 수 있는 연구결과에 기초하여, 83%의 특이성 및 88%의 민감도를 가진 85%의 전체 적인 일치로 이끌어 내는 결과를 비교하였다.
세포 생존가능성의 측정 외에, 사이토카인 방출과 같은 다른 종점, LDH 분석시험을 통한 세포 용해 또는 막 무결성의 검사는 평가될 수 있지만 유효성 검사 연구에는 필요하지 않았다. 따라서, 노광 시스템(예를 들어, CULTEX RFS)은 시험된 공수 입자의 급성 흡입 독성에 대한 질적 평가를 위한 예측 스크리닝 시스템으로서 입증되었으며, 동물 실험에 대한 유망한 대체 방법을 나타낸다. 다음 프로토콜은 이 노출 시스템을 사용하여 공중 입자에 대한 노출 실험에 권장됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
많은 비동물 흡입 독성 시험 모델은 흡입 가능한 입자의 급성 흡입 위험에 대한 정보를 얻고 3R 원리25에따라 동물 실험을 감소 및 대체하기 위해 최근에 개발되었다.
세포 배양 모델의 관점에서, 세포의 노출은 침수 된 조건 또는 ALI에서 수행 될 수있다. 침수 된 조건 하에서 세포를 노출하는 것은 물리 화학적 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서, 시험 물?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 독일 연방 교육 연구부 (분데스 장관 퓌르 빌둥 und Forschung, BMBF, 독일 (그랜트 031A581, 하위 프로젝트 A-D))와 독일 연구 재단 (도이치 포슈슈젤샤프트, DFG) 지원되었다, 연구 훈련 그룹 GRK 2338).
Materials
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
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